鸡蛋卵转铁蛋白过敏原的体外模拟消化特性

王靖舒，佟 平，陈红兵，3，高金燕*

（1 南昌大学食品科学与技术国家重点实验室 南昌330047 2 南昌大学食品学院 南昌330047 3 南昌大学中德联合研究院 南昌330047）

食物过敏是部分特殊人群对食物产生的不良反应，其发生率呈逐年升高的趋势[1-3]。鸡蛋作为世界公认的八大类致敏性食物之一，其过敏原多存在于蛋清中，主要包括卵转铁蛋白、卵白蛋白、卵类粘蛋白和溶菌酶4 种[4-5]。其中，卵转铁蛋白（Ovotransferrin，OVT） 致敏性与卵类黏蛋白相似，是致敏性较强的蛋白之一[6]。目前对OVT 的研究主要为抗菌，抗炎，抗氧化活性，免疫调节等功能特性方面[7-10]，而对其消化稳定性、致敏性等方面了解非常有限。

过敏原蛋白耐胃、肠消化或形成较大片段，是其导致肠道黏膜免疫致敏的前提条件[11]，而且过敏原蛋白的胃、肠消化特性是食物过敏的关键因素[12]。小肠作为食物消化吸收中最主要的部分，主要分为肠腔消化和黏膜消化。小肠刷状缘膜酶（Small intestinal brush border membrane enzyme，简称BBM 酶） 是小肠刷状缘表面的一种消化酶，能够逐步分解多数小肽段和一部分多肽段[13]，被应用于很多研究[14-15]。曾有学者指出[16-17]，小肠粘膜期是蛋白质消化的重要环节，BBM 酶包括氨肽酶A、氨肽酶N、膜甘氨酰亮氨酸肽酶、二肽基肽酶、γ-谷氨酰转移酶、羧基酞酶和锌稳定性天冬氨酰赖氨酸肽酶等7 种类型，主要与各类寡肽和二肽的水解、氨基酸吸收和二肽转运有关。James 等[18]也曾指出，黏膜消化是各种养分的最终消化阶段，肠黏膜是所有养分的最终消化场所。目前有关BBM 酶进一步消化OVT 的胃-小肠消化产物的研究鲜有报道。

结合OVT 的研究现状及婴幼儿、成年人的胃、肠发育状况，本研究在体外静态消化模式下，分别模拟婴幼儿和成年人胃液、小肠液以及BBM酶对OVT 的消化。采用Tricine-SDS-PAGE 和MALDI-TOF-MS 结合方法分析各消化阶段的产物，探讨各阶段不同条件下消化产物的变化，旨在阐明OVT 的胃、肠消化特性，为进一步理解婴幼儿与成年人食物过敏的差异性提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验与试剂

新鲜鸡蛋，市售。

DEAE-Sepharose Fast Flow，美国GE 公司；胃蛋白酶等消化酶及消化所需其它试剂，美国Sigma 公司；BBM 酶（活性为0.072 U/mg 蛋白），南昌大学食品科学与技术国家重点实验室自制；SDS-PAGE 凝胶配制所用试剂，上海生工生物工程有限公司；大分子预染蛋白Marker、小分子非预染蛋白Marker，美国Thermo 公司；α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA），日本岛津公司；HCl、NaHCO3、NaCl、NaOH、冰乙酸、无水乙醇、无水甲醇等化学试剂均为国产分析纯级。

1.2 设备与仪器

DHL-A 电脑恒流泵、HD-21 核酸蛋白检测仪、数控计滴自动部分收集器、TH-500 梯度混合仪，上海青浦沪西仪器厂；N2000 色谱工作站，浙江大学智达信息工程有限公司；Mini 蛋白电泳仪、GS-800 凝胶成像系统，美国Bio-Rad 公司；MAL DI-TOF-MS 质谱仪，日本岛津公司。

1.3 试验方法

1.3.1 卵转铁蛋白（OVT） 的分离纯化 参考佟平[19]的蛋清预处理及分离纯化OVT 的方法，提取蛋清蛋白，采用浓缩胶浓度4%、分离胶浓度12%的SDS-PAGE 对各洗脱峰进行鉴定，收集纯度符合试验条件的OVT 提取液进行超滤浓缩，最终采用BCA 试剂盒测定浓缩的OVT 提取液浓度。

1.3.2 体外模拟婴幼儿及成年人胃肠消化 参考Dupont 等[20]的方法，稍作改进，并设置不同条件进行胃、肠消化过程，具体如下。

1.3.2.1 体外模拟婴幼儿胃肠消化 胃消化不同时间条件：pH 2.5，胃蛋白酶（22.75 U/mg 蛋白），75 mmol/L NaCl，37 ℃分别孵育0，30，60，90，120 min。取5 支10 mL EP 管，先后加入模拟胃液1 mL 和1 mg/mL OVT 提取液1 mL，混匀后进行孵育。加入1 mol/L NaHCO3调节pH 值至中性，终止消化。消化产物用于分析。

胃消化不同pH 值条件：胃蛋白酶（22.75 U/mg 蛋白），75 mmol/L NaCl，pH 值分别为1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，37 ℃孵育1 h。取5 支10 mL EP 管，先后加入不同pH 值的模拟胃液1 mL 和1 mg/mL OVT 提取液1 mL，混匀后于37 ℃孵育1 h，加入1 mol/L NaHCO3调节pH 值至中性，终止消化。消化产物用于分析。

肠消化不同时间条件：pH 6.5，牛α-糜蛋白酶（0.04 U/mg 蛋白），猪胰蛋白酶（3.45 U/mg 蛋白），1 mmol/L 牛黄胆酸钠，1 mmol/L 甘氨脱氧胆酸钠，26.1 mmol/L Bis-Tris 缓冲液，37 ℃分别孵育0，30，60，90，120 min。取5 支10 mL EP 管，先后加入婴幼儿模拟胃液1 mL 和1 mg/mL OVT 提取液1 mL，混匀后于37 ℃孵育1 h，加入适量1 mol/L NaHCO3调节pH 值至中性。再加入婴幼儿模拟肠液2 mL，37 ℃孵育一定时间后，100 ℃恒温加热5 min，终止反应。消化产物用于分析。

1.3.2.2 体外模拟成年人胃肠消化 胃消化不同时间条件：pH 2.0，胃蛋白酶（182 U/mg 蛋白），50 mmol/L NaCl，37 ℃分别孵育0，30，60，90，120 min。消化方法同1.3.2.1 胃消化不同时间条件。

胃消化不同pH 值条件：胃蛋白酶（182 U/mg蛋白），50 mmol/L NaCl，pH 值分别为1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，37 ℃孵育1 h。消化方法同1.3.2.1 胃消化不同pH 值条件。

肠消化条件：pH 6.5，牛α-糜蛋白酶（0.44 U/mg 蛋白），猪胰蛋白酶（34.5 U/mg 蛋白），4 mmol/L牛黄胆酸钠，4 mmol/L 甘氨脱氧胆酸钠，26.1 mmol/L Bis-Tris 缓冲液，37 ℃分别孵育0，30，60，90，120 min。消化方法同1.3.2.1 肠消化不同时间条件。

1.3.3 体外模拟婴幼儿及成年人BBM 酶消化取2 支10 mL EP 管，先后加入婴幼儿/成年人模拟胃液1 mL，1 mg/mL OVT 提取液1 mL，混匀后于37 ℃孵育1 h；加入1 mol/L NaHCO3调节pH值至中性，再对应加入婴幼儿/成年人模拟肠液2 mL，混匀后37 ℃孵育1 h 后加入50 μL BBM 酶溶液，混合均匀37 ℃温度孵育2 h，100 ℃恒温加热5 min 终止反应。消化产物用于分析。

1.3.4 Tricine-SDS-PAGE 及MALDI-TOF-MS 分析 OVT 经体外模拟婴幼儿和成年人胃、小肠及BBM 酶连续消化的各阶段产物，采用Tricine-SDS-PAGE 及MALDI-TOF-MS 分别分析。Tricine-SDS-PAGE 所用致密胶浓度为16.5%，夹层胶浓度为10%，分离胶浓度为4%，量程设置为30 V（1 h）～100 V（2 h）。MALDI-TOF-MS 质谱分析试验参数：线性正离子谱模式，N2激光源，波长337 nm，离子源加速电压25 kV，脉冲宽度3 nS，叠加108，基质为CHCA。取样品0.5 μL 于样品孔中心，加入基质0.5 μL，室温晾干结晶后放入质谱仪中测试。

1.3.5 数据分析 超滤浓缩OVT 的浓度试验重复3 次，利用Microsoft Excel 2010 统计处理，采用Origin 9.0 作图分析。Tricine-SDS-PAGE 采用GS-800 凝胶成像系统成像。MALDI-TOF-MS 采用Shimadzu Biotech Launchpad 软件采集信息并成图。

2 结果与分析

2.1 OVT 的分离纯化

通过SDS-PAGE 对蛋清分离产物鉴定，图1a中泳道1～2 中78 ku 处出现OVT 条带且纯度大于92.5%，泳道3～4 中除OVT 外含有其它蛋白，纯度较低。收集符合试验条件（泳道1～2）的所有OVT提取液，通过超滤浓缩、BCA 试剂盒测得其质量浓度为6.24 mg/mL。

图1 OVT 纯度鉴定（a）及浓度测定（b）Fig.1 Purity identification（a） and concentration determination（b） of ovotransferrin

2.2 OVT 在体外模拟婴幼儿和成年人胃液中的消化

在消化过程中，胃主要通过研磨（胃窦的机械研磨）和胃分泌物的联合作用来分解食物结构。一般研究食物胃消化时，设置模拟胃消化时长为1 h，模拟胃液pH 值多为1.5～2.5。结合婴幼儿及成年人胃发育及胃消化特点，本试验分别设置胃消化时间和消化液pH 值梯度变化，探讨不同条件对OVT 的消化影响。

2.2.1 不同消化时间对胃消化的影响

2.2.1.1 消化时间对模拟婴幼儿胃消化OVT 的影响 体外模拟婴幼儿胃消化不同时间，OVT 产物结果分析见图2。图2a 中，婴幼儿胃消化产物主要分布在5～15 ku 和30～50 ku。胃消化伊始，OVT 产物数量多且呈弥散状。Hoppe 等[21]发现OVT 在胃蛋白酶消化液（pH 1.2）中孵育30 s 消失，Wang等[22]也提到OVT 对胃蛋白酶水解较为敏感，说明OVT 对胃蛋白酶没有抵抗力。随着消化时间的延长，泳道2～5 的条带表示消化产物基本相同而丰度不同，产物中分子质量较大的产物进一步逐渐分解为分子质量较小的蛋白。图2b 为质谱图出峰范围5～13 ku 区域。胃消化伊始，OVT 产物分子质量分布在5～13 ku，6.8，7.0，7.9 ku 及10.1 ku 处离子峰信号较强，相对强度较高。随着消化时间的延长，谱图2～5 中10 ku 处吸收峰消失，产物分子质量均分布在5～8 ku 之间，出峰趋势相同，部分离子峰信号强度随时间变化而变化，说明胃消化时间对消化产物具有一定影响。

由图2可知，体外模拟婴幼儿胃消化OVT 的产物分子质量范围为5～15 ku 和30～50 ku，且胃消化形成的产物以前者居多。随着胃消化时间的延长，OVT 在婴幼儿模拟胃液中逐步降解，也生成了分子质量5.5，6.8，8.4 ku 的耐消化蛋白质。

2.2.1.2 消化时间对模拟成年人胃液消化OVT 的影响 OVT 在成年人模拟胃液中的消化产物分析图见图3。图3a 中，OVT 由78 ku 大分子蛋白分解为5～14 ku 和30～50 ku 蛋白。胃消化30～120 min时，10 ku 处条带逐渐变浅至消失，而7 ku 处条带逐渐变深，这与刘光明等[23]体外模拟胃消化日本鳗鲡胶原蛋白的降解趋势一致，即随消化时间的延长，分子质量较大的降解产物逐渐减少，分子质量较小的降解产物则增加。图3b 显示MALDITOF-MS 出峰范围为5～10 ku。成年人胃消化伊始，产物以5～8 ku 蛋白为主，而图2b 谱图1显示婴幼儿胃消化0 min 时的产物以6～11 ku 的蛋白居多，说明OVT 在成年人模拟胃液中更易被降解为分子质量偏小的蛋白，即短时间内成年人胃消化OVT 的能力较婴幼儿强。OVT 在成年人胃液中消化30 min 时，生成5.5，6.8 ku 的蛋白，产物种类明显减少。随着消化时间的延长，5.5 ku 的蛋白未发生变化，较耐胃消化；而6.8 ku 处吸收峰消失，即该分子质量蛋白发生酶解。

图2 OVT 在体外模拟婴幼儿胃液消化不同时间的产物Tricine-SDS-PAGE（a）及MALDI-TOF-MS（b）图谱Fig.2 Tricine-SDS-PAGE patterns（a） and MALDI-TOF-MS profiles（b） of ovotransferrin digested by simulated infant gastric juice in vitro at different times

结合图2及图3可知，成年人胃消化的产物分子质量范围与婴幼儿胃消化产物范围一致。在成年人胃消化60 min 时，OVT 已基本消化完全。试验证明OVT 可随着消化时间的延长在成年人模拟胃液中逐步降解，生成5.5 ku 耐胃消化蛋白。

OVT 在婴幼儿和成年人模拟胃液中均随消化时间延长而逐渐降解，这与简姗[24]的研究结果一致。黄园园等[25]对甲壳类动物中主要过敏原原肌球蛋白进行模拟胃消化也得出相同结论。此外，婴幼儿和成年人消化产物中均含有5.5 ku 耐消化蛋白，而成年人胃消化产物种类较少，这是因为婴幼儿胃液中盐酸和各种酶的分泌均较成人少且酶活力低，导致消化功能差[26]。成年人各消化系统发育完全，体内消化液中各成分的分泌量均高于婴幼儿，消化功能也随之增强。

图3 OVT 在体外模拟成年人胃液消化不同时间的产物Tricine-SDS-PAGE（a）及MALDI-TOF-MS（b）图谱Fig.3 Tricine-SDS-PAGE patterns（a） and MALDI-TOF-MS profiles（b） of ovotransferrin digested by simulated adult gastric juice in vitro at different times

2.2.2 不同pH 值对胃消化的影响 胃功能不健全的婴儿、胃溃疡患者等人群在功能紊乱或胃液分泌不足时，胃液的酸度较低，对食物的消化作用有一定影响。在用餐后，人体胃液pH 值会升至3或更高[27-28]。因此，本试验设置梯度pH 值变化，探究模拟胃液pH 值对OVT 胃消化稳定性的影响，并根据不同pH 值条件，消化相同时间生成的产物种类、含量和较大分子质量产物的降解状态，结合已报道的胃内正常pH 值范围，确定OVT 在婴幼儿及成年人胃液中最易消化的pH 值。

2.2.2.1 胃液pH 值对模拟婴幼儿胃液消化OVT的影响 体外模拟婴幼儿在不同pH 值条件下消化OVT 1 h 的产物分析图见图4。图4a 中，婴幼儿模拟胃液pH 值在1.5～2.5 范围时，OVT 多被消化为5～12 ku 左右的蛋白，pH 值的升高使OVT 降解产物中的大分子蛋白逐步被水解为小分子蛋白，在胃液环境pH 值为2.5 时，大于10 ku 的条带已基本消失；胃液环境pH 值为3.0 时，OVT 被消化为10～30 ku 左右的蛋白，条带数目较多并弥散状；pH 值为3.5 时，OVT 基本不会被消化，在78 ku 处呈清晰条带。简姗[24]的结果也表明，在模拟胃液pH 3.5 条件下，OVT 消化2 min 后仍有大量未降解的蛋白条带。图4b 中，模拟胃液pH 值为3.5时，OVT 发生不完全降解，可检测到完整的OVT蛋白和少部分经过胃消化生成的5～10 ku 的蛋白；在pH 1.5～3.0 条件下，OVT 都能够被消化为分子质量为5～10 ku 的蛋白。进一步缩小谱图范围至5～10 ku，得到图4c，胃液pH 值为1.5～2.5时，OVT 胃消化产物基本相同，然而随着pH 值的升高，5.5，6.8，7.7，8.4 ku 等吸收峰强度有所变化，说明pH 值对胃消化具有一定影响，与其它试验结果一致[29-30]；在pH 3.0 条件下，OVT 胃消化产物的吸收峰数量减少，消化产物分子质量较大，消化能力减弱。因此，OVT 在模拟胃液pH 2.5 条件下进行消化，产物中较大分子蛋白减少，更容易被降解。

图4 OVT 在体外模拟婴幼儿胃液消化不同pH 值的产物Tricine-SDS-PAGE（a）及MALDI-TOF-MS（b，c）图谱Fig.4 Tricine-SDS-PAGE patterns（a） and MALDI-TOF-MS profiles（b，c） of ovotransferrin digested by simulated infant gastric juice in vitro at different pH values

图5 OVT 在体外模拟成年人胃液消化不同pH 值的产物Tricine-SDS-PAGE（a）及MALDI-TOF-MS（b）图谱Fig.5 Tricine-SDS-PAGE patterns（a） and MALDI-TOF-MS profiles（b） of ovotransferrin digested by simulated adult gastric juice in vitro at different pH values

图4说明OVT 在pH 1.5～3.0 条件下，婴幼儿模拟胃液中可被完全消化，在pH 3.5 条件下少部分发生消化，其中最易消化pH 值为2.5。

2.2.2.2 胃液pH 值对模拟成年人胃液消化OVT的影响 据文献[31]报道，成人胃在禁食状态下的pH 值通常为1.7～1.9。本试验设置成年人模拟胃液pH 值范围为1.0～3.0，消化产物分析图见图5。图5a 中，OVT 在pH 1.0～3.0 条件下均可发生降解。当pH 值为1.0～1.5 时，OVT 被消化为8，10 ku的蛋白；随着pH 值升至2.5，10 ku 处条带逐渐变浅直至消失；pH 3.0 时，胃蛋白酶的活力受pH 值的影响而较弱，OVT 被酶解的程度较低，生成30 ku 的大分子片段。相同pH 值条件下，婴幼儿胃消化产物种类比成年人的多，尤其在pH 3.0 时，婴幼儿胃消化产物条带分布在10～30 ku，远大于成年人的消化产物范围5～10 ku。这与成年人模拟胃液中胃蛋白酶的酶活度较高有关。因此，在相同pH 值的胃消化条件下，成年人消化能力较婴幼儿更强。图5b 中，成年人模拟胃液pH 值为1.0～1.5时，OVT 消化产物基本相同，而对应离子峰强度不同；在pH 2.0 时，产物种类明显减少，较大分子质量蛋白质发生降解，且在pH＞2.0 条件下，均生成5.3，5.5 ku 蛋白。因此，在pH 1.0～3.0 的消化环境中，pH 值的升高使OVT 被消化成小分子产物的含量有所增加。这是因为随着pH 值的升高，胃蛋白酶形成较少，酶活受到部分抑制，导致蛋白消化能力有所降低[30]。产物5.5 ku 处蛋白未因pH 值的变化发生降解，较耐消化。

图5结果表示，在pH 1.0～3.0 范围内模拟成年人胃消化，OVT 胃消化产物种类随着pH 值的升高而减少，pH 2.0 时，OVT 最易被消化，这与胃蛋白酶在pH 2.0 附近具有最大活性密切相关[32]。Dekkers 等[33]的试验也表明在一定范围内，pH 值越高消化能力越弱，pH 值越低越有利于食物蛋白消化。比较相同pH 值条件的婴幼儿及成年人胃消化结果，可知婴幼儿胃消化产物种类多且分子质量相对偏大；婴幼儿与成年人胃消化不同时间、不同pH 值条件下均生成较耐消化的5.5 ku 蛋白，该片段值得进一步研究。

2.3 体外模拟婴幼儿和成年人小肠液中的消化

肠道是食物消化的主要部位，食物经胃消化后，其产物进入小肠，并通过胰蛋白酶和胆汁分泌物的协同作用进行消化过程[34]。Bourlieu 等[26]详细研究了婴儿和肠道状况的生化差异，Poquet 等[32]也提到消化道不成熟致使婴幼儿胰蛋白酶消化能力有限。根据2.2.2 节的结果，OVT 分别在婴幼儿和成年人最易消化的pH 值条件下胃消化1 h，再进行小肠消化，以此探讨不同肠消化时间内OVT被消化的特点。

2.3.1 不同消化时间对体外模拟婴幼儿肠消化的影响 OVT 经婴幼儿模拟胃液（pH 2.5） 消化1 h，小肠消化不同时间的产物分析图见图6。图6a中，胃-小肠消化后的产物分子质量大小在3.4～10 ku 之间，较OVT 的胃消化产物明显发生进一步酶解。随着消化时间的延长，胃-小肠消化产物中分子质量偏大的产物含量被进一步消化分解，如10 ku 处条带在消化120 min 时颜色变浅。图6b 中，不同消化时间条件下的胃-小肠消化产物基本相同，产物分子质量分布在0.5～1.0 ku，其中0.495，0.559，0.638 ku 等肽段受消化时间影响较小，较耐消化。

图6 OVT 在体外模拟婴幼儿肠液消化不同时间的产物Tricine-SDS-PAGE（a）及MALDI-TOF-MS（b）图谱Fig.6 Tricine-SDS-PAGE patterns（a） and MALDI-TOF-MS profiles（b） of ovotransferrin digested by simulated infant intestinal fluid in vitro at different times

2.3.2 不同消化时间对体外模拟成年人肠消化的影响 OVT 经成年人模拟胃液（pH 2.0）消化1 h，小肠消化不同时间的产物分析图见图7。与图6a 相比，图7a 中成年人胃-小肠消化产物分子质量较小，基本分布在5～10 ku。小肠消化0 min 时条带呈弥散状态，7 ku 处有一条较为清晰的细条带；随着消化时间的延长，该条带逐渐被降解。图7b 中显示成年人的OVT 胃-小肠消化产物存在分子质量＜1 ku 的肽。小肠消化时间对OVT 胃消化产物被进一步酶解的影响较小，且不同时间消化形成产物基本相同，主要生成0.495，0.560，0.638 ku 及0.666 ku 的小分子肽。

比较图6及图7可知，婴幼儿胃-小肠产物分子质量范围相对较大，生成片段也相对较多，说明婴幼儿小肠消化能力相对较弱；OVT 在婴幼儿及成年人胃液-小肠液消化后均生成0.495，0.560，0.638 ku 较耐消化的多肽，且消化时间对肠消化产物影响较小。Picariello 等[35]表示肠道消化基本在2 h 内完成，在较长的孵育时间内肽型未发生明显变化。

2.4 体外模拟婴幼儿及成年人BBM 酶消化

经过胃消化的食糜进人小肠后，在胰酶作用下产生可吸收的终产物，通过上皮细胞刷状缘膜上表达的水解酶将肠腔里的养分进一步消化[36]。有报道指出[16]，食物蛋白质经过肠腔内消化后形成的大量寡肽发生进一步水解时，其中大部分二肽和少量三肽经转运后由细胞浆肽酶水解，而约10%二肽、60%三肽及几乎全部三肽以上的寡肽均由BBM 酶水解，最后形成氨基酸。

图7 OVT 在体外模拟成年人肠液消化不同时间的产物Tricine-SDS-PAGE（a）及MALDI-TOF-MS（b）图谱Fig.7 Tricine-SDS-PAGE patterns（a） and MALDI-TOF-MS profiles（b） of ovotransferrin digested by simulated adult intestinal fluid in vitro at different times

OVT 经过婴幼儿和成年人胃、小肠分别消化后，加入BBM 酶进一步消化得到终消化产物，其分析图见图8。图8a 泳道1 中，婴幼儿胃-小肠消化产物分子质量为3.4～10 ku，30～50 ku，再经BBM 酶消化后30～50 ku 处条带数量明显减少，颜色变浅，仅剩5～13 ku 范围内少数条带。图8a 泳道2 显示，成年人胃-小肠消化产物分子质量分布范围为5～10 ku，经BBM 酶进一步消化后几乎没有条带，说明OVT 被消化的较为彻底。图8b 中，婴幼儿和成年人的OVT 终消化产物分子质量集中在0.4～0.7 ku 范围内，0.560 ku 肽段含量均最多，而婴幼儿消化产物的种类居多，其中最大分子质量产物为0.680 ku，超过成年人产物中最大分子质量产物（0.666 ku）。再结合图6、图7对比可知，0.495，0.560，0.638 ku 处片段较耐酶消化，且婴幼儿终消化产物中含有耐消化的大分子蛋白，可以推测婴幼儿更易发生OVT 的肠道黏膜免疫致敏。

OVT 经过胃、小肠消化后，增加BBM 酶消化可明显增强婴幼儿及成年人胃-小肠消化产物的进一步酶解，该结论与其它研究报道相同。Picariello 等[37]发现加入BBM 酶后，牛奶蛋白水解程度高达80%，由此提出在体外模拟食物蛋白消化时应增加BBM 酶消化阶段。Mamone 等[38]也证实十二指肠消化肽可被BBM 肠上皮细胞的内/外肽酶进一步水解为单一氨基酸或短的双或三肽。Gianfrani 等[39]表示在模拟肠消化后增加BBM 酶消化可以降低醇溶蛋白的免疫刺激活性。游义娇[30]在麸质蛋白消化中加入BBM 酶消化过程，终消化产物中麸质含量降低，小麦蛋白的水解度明显提高。

图8 OVT 在体外模拟婴幼儿及成年人BBM 酶消化产物Tricine-SDS-PAGE（a）及MALDI-TOF-MS（b）图谱Fig.8 Tricine-SDS-PAGE patterns（a） and MALDI-TOF-MS profiles（b） of ovotransferrin digested by simulated infant and adult BBM in vitro

目前有关蛋白质在体外模拟消化方法多参照美国药典的模拟胃肠消化，或采用传统的口腔-胃-肠3 步消化法，然而这些模拟消化模型提供的信息有限，只能评估蛋白质（或大多肽）的消化率，即消化稳定性，而忽略了肠黏膜水解酶在人体生理学中的作用[40]。结合解剖学及生理学等多方面数据，有研究[40]提出BBM 酶可辅助食物最终消化，有利于蛋白质在人体胃肠道中的消化和吸收，且在最终消化阶段发挥关键功能，尤其是将多肽逐渐缩短为寡肽和游离氨基酸[41]。Minekus 等[42]通过对人体生理条件的分析，将BBM 酶的消化过程也纳入多种食物通用的标准化静态体外消化模型中，目前是国际公认的一种标准化的消化模式。因此，在研究体外模拟胃肠消化蛋白质时，应加入BBM 酶消化阶段以研究其在肠道消化中的降解作用。

3 结论

本文通过模拟婴幼儿及成年人胃液、小肠液及小肠刷状缘膜酶（BBM 酶）的体外静态消化环境，发现鸡蛋蛋清过敏原卵转铁蛋白（OVT）在婴幼儿和成年人消化体系中均可被降解。在模拟婴幼儿消化体系中，OVT 胃消化产物分子质量范围为5～15 ku 和30～50 ku，进一步经小肠消化后的产物分布在0.4～10 ku，最后经小肠刷状缘膜酶消化生成0.5～0.7 ku 肽段及部分5～13 ku 蛋白。OVT经模拟成年人胃消化的产物分子质量范围与模拟婴幼儿的一致，胃-小肠消化主要生成0.5～0.8 ku肽段，再经小肠刷状缘膜酶消化生成0.5～0.7 ku肽段。此外，OVT 在胃液pH 值低于3.0 时可被消化，其在婴幼儿和成年人胃消化中最易消化的pH值分别为2.5，2.0；随着消化时间的延长，OVT 在模拟胃液中逐渐降解，可生成5.5 ku 耐胃消化片段，然而在模拟小肠液中，未随时间发生显著变化，生成0.495，0.560，0.638 ku 较耐肠、耐BBM 酶消化的多肽。这些耐消化片段均值得进一步研究。

试验表明成年人消化能力相对较强，而婴幼儿消化能力则较弱，导致OVT 经婴幼儿胃、小肠及BBM 酶消化后，产物中仍含有耐消化的大分子蛋白，提示更易发生OVT 过敏。另外，该研究初步揭示了OVT 体外胃肠消化的规律，为进一步明确OVT 耐胃肠消化片段与致敏性的关系提供了良好的工作基础。