E- 4031 对遗传性长QT 综合征hERG 通道功能影响的研究

黄晓燕 王英 廉姜芳

遗传性长QT 综合征（hereditary long QT syndrome，hLQTs）是因编码心肌离子通道蛋白基因突变导致心肌细胞膜离子通道功能障碍的一组临床综合征，常于青少年发病，是青少年猝死的主要原因。其中Ⅱ型长QT 综合征（long QT syndrome 2，LQT2）的发生与快激活延迟整流钾电流（rapidly activating component of delayed rectifier potassium current，IKr）的减少有关，这是由于编码IKr通道α 亚单位的人类ether-a-go-go 相关基因（human ether-a-go-gorelated gene，hERG）的突变引起[1]。迄今为止，已发现了500 多个hERG 基因突变位点，其中大多为错义突变[2-3]，G572R 突变是其中之一。已知G572R 突变导致其编码的蛋白质合成和转运障碍，突变蛋白滞留于内质网，无法转运至细胞膜上形成有功能的离子通道，导致编码的IKr电流减少和心室复极延迟。目前对LQT2 患者缺乏特异性诊断及有效治疗方法。本研究探讨药物E-4031 对WT/G572R-hERG杂合型通道功能的影响，现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 主要试剂 DMEM 培养基购自美国Thermo scientific 公司；转染试剂（LipofectaminTM2000）购自美国Invitrogen 公司；兔抗hERG 多克隆抗体购自以色列Alomone 公司；E-4031 购自德国Calbiochem 公司；膜片钳系统及分析软件为美国Axon 公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养、转染 HEK293T 细胞常规用含10%胎牛血清DMEM 培养基培养，根据转染试剂提供的实验步骤，将2.5 μg pcDNA3-WT-hERG 质粒和2.5 μg pcDNA3-G572R-hERG 质粒，瞬时转染HEK293T 细胞，构建WT/G572R-hERG 细胞株。同时共转染0.8 μg绿色荧光蛋白以监测转染效率。

1.2.2 药物干预 构建WT/G572R-hERG 细胞株后，将其分为两组，观察组加入E-4031 孵育24h，作用浓度为5 μmol/L。对照组用含10%胎牛血清DMEM 培养基常规培养24 h。

1.2.3 hERG 通道蛋白表达的检测 采用Western blot 法检测两组hERG 通道蛋白的表达。收集两组细胞，加入预冷蛋白裂解液。取裂解上清液加样，经7.5%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜至聚偏二氟乙烯膜。一抗兔抗hERG 多克隆抗体1∶400 稀释，4 ℃孵育过夜。二抗辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体1∶1 000 稀释，室温孵育2 h，最后在化学发光成像仪中观察拍照。

1.2.4 hERG 通道激活电流和尾电流的检测 采用全细胞膜片钳技术观察两组hERG 通道激活电流和尾电流的电流幅度、半激活最大电压和斜率因子。电极外液配方：NaCl 137 mmol/L，KCl4mmol/L，CaCl21.8 mmol/L，MgCl2·6H2O 1 mmol/L，葡萄糖10 mmol/L，HEPES 10 mmol/L（最后加入NaOH 将pH 调至7.4）。电极内液配方：KCl 130 mmol/L，MgCl21 mmol/L，EGTA 5 mmol/L，Mg-ATP 6 mmol/L，HEPES 10 mmol/L（最后加入KOH 将pH 调至7.2）[4-5]。灌注电极内液后电极入水电阻为3～7 mΩ；刺激程序由Clampex 9.2 软件和Axon 700B 放大器共同完成，信号经过Axon 700B 放大器和A/D 转换后储存于计算机中。将细胞钳制在-80 mV，测试电压以10 mV 阶跃从-60 mV 刺激到+60 mV，持续时间2 s；然后去极化到-40 mV，持续4 s；最后回到-80 mV[4-5]，记录hERG通道激活电流和尾电流的电流幅度。对在-40 mV记录到的尾电流经最大电流标准化，用Boltzmann方程拟合，得出两组半激活最大电压和斜率因子并进行比较。

1.2.5 hERG 通道稳态失活电流的检测 方法同hERG 通道激活电流和尾电流。测试电压以10 mV阶跃从-130 mV 刺激到20 mV，持续时间20 ms；然后测试电压钳制在20 mV 时记录hERG 通道稳态失活电流，经最大电流标准化，用Boltzmann 方程拟合，得出两组半失活最大电压和斜率因子并进行比较。

1.2.6 hERG 通道失活恢复电流的检测 方法同hERG 通道激活电流和尾电流。电压钳制在-80 mV，复极至50 mV 使通道失活，接着以10 mV 的阶跃从-30 mV 刺激到-120 mV，持续时间3 s，记录两组hERG 通道失活恢复电流，用单指数方程进行拟合得到失活恢复时间常数并进行比较。

1.3 统计学处理 采用Excel 和Origin7.5 软件对原始数据进行统计、拟合和作图。计量资料以表示，两样本比较采用配对t 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组hERG 通道蛋白表达的比较 见图1。

图1 两组hERG 通道蛋白表达的比较（A：两组hERG 蛋白条带的变化，B：两组hERG 蛋白的灰度值比较；与对照组比较，*P＜0.05）

由图1 可见，对照组在135 kDa 和155 kDa 出现两条蛋白质条带，而观察组155 kDa 的蛋白质条带明显增强，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 两组hERG 通道激活电流和尾电流的电流幅度、半激活最大电压和斜率因子的比较 见图2。

由图2 可见，对照组hERG 通道激活电流和尾电流的最大电流幅度分别是（219.34±28.98）pA 和（566.61±121.60）pA，而观察组hERG 通道激活电流和尾电流的最大电流幅度分别是（416.32±90.37）pA和（897.25±92.05）pA。与对照组比较，观察组hERG 通道激活电流和尾电流的最大电流幅度分别增加了89.81%和58.35%，差异均有统计学意义（P＜0.05）。此外对照组尾电流拟合后半激活最大电压和斜率因子分别是（4.51±0.41）mV 和（8.99±0.37），观察组分别是（6.37±1.09）mV 和（10.40±0.99），两组尾电流拟合后半激活最大电压和斜率因子比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

2.3 两组hERG 通道稳态失活电流半失活最大电压和斜率因子的比较 见图3。

由图3 可见，观察组和对照组hERG 通道稳态失活电流半失活最大电压分别为（-83.39±1.45）mV和（-69.05±2.58）mV，差异有统计学意义（P＜0.05）；斜率因子分别为（24.99±1.18）和（28.94±2.90），差异无统计学意义（P ＞0.05）。

2.4 两组hERG 通道电流失活恢复时间常数比较见图4。

由图4 可见，两组hERG 通道电流失活恢复时间常数比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。

图2 两组hERG 通道激活电流和尾电流的电流幅度、半激活最大电压和斜率因子的比较（A：两组hERG 通道激活电流和尾电流图；B：两组激活电流的电流幅度；C：两组尾电流的电流幅度；D：两组尾电流经拟合得出半激活最大电压和斜率因子）

3 讨论

LQT2 是由于hERG 基因突变引起的一组心脏离子通道病。hERG 基因编码的蛋白是由4 个亚基组成的四聚体，每个亚基有6 个跨膜片段（S1-S6），其中S5-S6 之间的疏水性环为最保守的区域，向膜内折叠形成离子孔道的孔区。正常的hERG 通道蛋白有两种形式：一种是存在于内质网未完全糖基化的135 kDa 大小前体；另一种是经高尔基体复杂糖基化修饰后，插入细胞膜上的成熟的155 kDa 大小通道蛋白。G572R 错义突变位于hERG 通道的S5跨膜片段末端，572 位的甘氨酸被精氨酸所取代。G572R 突变发生时，突变的通道蛋白会与野生型蛋白结合形成杂合型通道（Western blot 表现为155 kDa和135 kDa 两个蛋白条带，但155 kDa 的蛋白质条带明显弱于野生型细胞），滞留于内质网中，从而减少野生型蛋白在细胞膜上的表达，使细胞膜上有功能的离子通道减少[6]。这些突变蛋白尤其是杂合型通道，并非功能完全丧失，若对其调控后能部分纠正或者恢复正常转运，仍能发挥一定的代偿功能[7-9]。

药物分子对突变蛋白的改善和纠正作用一直以来都是研究的热点[10]。E-4031 属于Ⅲ类抗心律失常药。有研究报道发现，G601S、R534C、A422T、V630L和N407D 突变，其编码的HERG 钾通道存在蛋白转运障碍，可以被E-4031 所部分纠正或恢复，但A561V、H562P、R752W、F805C 和R823W 突变体则不能被E-4031 所纠正[11-13]。本研究发现，与对照组比较，观察组hERG 通道蛋白质条带明显增强；全细胞膜片钳检测发现，hERG 通道激活电流幅度和尾电流幅度较干预前分别增加了89.81%和58.35%。可见E-4031 对G572R 突变导致的蛋白转运障碍起到了部分改善和纠正作用。此外，E-4031 干预使得hERG 通道稳态失活电流的电向明显负向移动14.34 mV，可见E-4031 干预还加速了通道电流的稳态失活速度。

对于不同的hERG 基因突变位点，E-4031 处理有着不同的反应，这提示不同突变位点的蛋白构象及功能缺失的机制存在不同。本研究发现E-4031能改善WT/G572R-hERG 通道功能。因此，通过药物分子对HERG 通道功能的调节作用，以期从调控蛋白质转运角度，为改善HERG 通道功能提供有效方法。

图3 两组hERG 通道稳态失活电流半失活最大电压和斜率因子的比较（A：两组hERG 通道稳态失活电流图；B：稳态失活电流经拟合得出半失活最大电压和斜率因子）

图4 两组hERG 通道电流失活恢复时间常数比较（A：两组hERG通道失活恢复电流图；B：通道电流失活恢复时间常数图）