维生素D受体基因多态性与青少年代谢综合征空腹血糖受损的关系研究

曹 涵，张 文

(上海市松江区中心医院内分泌科，上海 201600)

青少年代谢综合征(adolescent metabolic syndrome，MS)已成为全球发病率非常高的，以肥胖、高血糖、血脂代谢异常为特征的一组临床症候群[1]。MS与心血管疾病、2型糖尿病的发生发展密切相关。胰岛素抵抗是MS发生的病理基础。研究显示，空腹血糖受损(impaired fasting glucose，IFG)与胰岛素抵抗密切相关，尤其是当空腹血糖高于6.1mmol/L时胰岛素抵抗更加严重[2]，而IFG增高则更有可能导致糖尿病的发生发展[3]。

众所周知，维生素D水平与儿童青少年生长发育密切相关。目前国外已有研究发现，维生素D水平降低与青少年肥胖、血糖升高、血脂异常及胰岛素抵抗密切相关[4-5]。但是目前国内对于维生素D受体(vitamin D receptor，VDR)基因多态性与MS空腹血糖受损的关系研究报道较少。基于此，本研究拟探讨维生素D受体基因多态性与MS患者维生素D水平及空腹血糖受损之间的关系，以期进一步分析和阐明维生素D在MS进展为糖尿病中的作用，为临床采取更为有效的治疗手段提供理论依据。

1资料与方法

1.1一般资料

选取2017年3月至2019年8月在上海市松江区中心医院接受治疗的青少年代谢综合征患者242例作为MS组。MS的诊断标准符合2012年中华医学会儿科分会内分泌遗传代谢学组、心血管学组及儿童保健学组共同推出的有关中国青少年MS定义的诊断标准[6]：年龄10～16岁，腰围(waist circumference，WC)≥中国儿童青少年同年龄同性别的第90百分位数节点值，同时还应具备至少以下两项：①空腹血糖(fasting plasma glucose，FPG)≥5.6mmol/L或已诊断为2型糖尿病；②收缩压(systolic blood pressure，SBP)≥130mmHg或舒张压(diastolic blood pressure，DBP)≥85mmHg；③高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)<1.03mmol/L；④空腹甘油三酯(triglycerides，TG)≥1.70mmol/L。纳入标准：①近3个月体重稳定；②除在学校进行体育活动以外，无规律性的运动习惯及活动；③家属签署知情同意书。排除标准：①有心血管事件者；②继发性肥胖、继发性高血压、肾脏性疾病、血脂紊乱以及严重肝肾功能不全者；③正在服用影响血压、肝功能、血糖、血脂以及维生素D水平的药物。其中男孩136例，女孩106例；年龄11～16岁，平均年龄(12.56±2.47)岁。MS组患者根据是否出现空腹血糖受损分为IFG亚组(n=72)和Non-IFG亚组(n=170)，IFG亚组空腹血糖6.1～7.0mmol/L，符合空腹血糖受损的诊断标准[7]。另选取同期在我院体检中心健康检查的青少年(NC组)200例，其中男孩113例，女孩87例；年龄10～16岁，平均年龄(12.17±2.26)岁。两组性别、年龄等一般资料具有可比性(均P>0.05)。本研究通过医院伦理委员会审核。

1.2研究方法

1.2.1临床资料及生化指标

收集各研究对象性别、年龄、身高、体重、腰围，计算体质指数(body mass index，BMI)。禁食10～12h后于次日清晨7:00至8:00，抽取各受试对象肘静脉血，检测FPG、空腹胰岛素(fasting insulin，Fins)、糖化血红蛋白(Hemoglobin A1c，HbA1c)、稳态模型胰岛素抵抗指数(homeostasis model assessment of insulin resistance，HOMA-IR)。采用全自动化分析仪检测血脂指标：TG、总胆固醇(total cholesterol，TC)、HDL-C、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)。采用酶联免疫试剂盒检测血清中1,25-二羟基维生素D3[1,25-(OH)2D3]。

1.2.2 PCR-RFLP技术检测VDR基因ApaⅠ位点多态性

将获得的受试对象血样标本250μL置于含有EDTA的EP管中，采用Axygen全血基因组DNA提取试剂盒提取样本中DNA，并保存于-80℃冰箱中备用；采用PCR-RFLP技术检测VDR基因ApaⅠ位点多态性。引物以及探针经Primer Express 2.0软件进行设计，并经上海生工生物科技有限公司合成。上游引物序列：5′-CGCGTACGATCGCTGGCTAGC-3′，下游引物序列：5′-GGCGATCGACTAAGTACGCTACTAC-3′。PCR扩增体系为25L，其中含有5L PCR缓冲液，上游及下游引物各0.5L，5U/L Taq DNA聚合酶0.25L，2.5mmol/L的dNTPs 4.0L，剩余加入双蒸水。SCN5A基因C5457T位点的扩增反应条件为：94℃预变性2min，而后按照94℃30s、59℃30s、62℃15s的顺序进行40个循环，最后以62℃延伸1min。PCR扩增产物经限制性内切酶酶切反应2h，而后在ABI-7500 fast RT-PCR电泳仪上进行反应，抽取10%的样本进行基因测序，从而确定基因分型检测的准确性。

1.3统计学方法

2结果

2.1各组对象临床资料比较

研究结果显示，MS组各亚组BMI、SBP、DBP、FPG、Fins、HbA1c、TG、HDL-C、HOMA-IR、1,25-(OH)2D3与NC组比较差异有统计学意义(F/χ2值分别为9.574、6.632、6.417、7.836、12.369、8.254、7.884、7.994、11.334、12.417，均P<0.05)，详见表1。

表1 MS亚组与NC组临床资料比较

2.2 VDR基因ApaⅠ扩增结果

扩增条带经凝胶电泳分析显示，纯合子(AA型)为一条明亮的条带(740bp)、杂合子(Aa)有三条带(740bp、530bp和210bp)，纯合子(aa)为两条带(530bp、210bp)，见图1。

图1 VDR基因ApaⅠ酶切电泳结果

2.3各组对象VDR基因ApaⅠ基因型及等位基因分布频率

研究结果显示，VDR基因ApaⅠ位点三种基因型及A、a等位基因频率在NC组、Non-IFG亚组及IFG亚组中符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，具有群体代表性。三组研究对象VDR基因ApaⅠ基因型及等位基因分布频率比较差异具有统计学意义，且aa基因型频率、a等位基因频率均在IFG亚组中最高，在NC组中最低(χ2值分别为36.954、31.501，均P<0.01)，见表2。

表2 两组患者VDR基因ApaⅠ基因频率与等位基因频率分布[n(%)]

2.4 IFG亚组不同基因型患者临床生化指标比较

研究显示，不同基因型患者FPG、HbA1c、Fins、HDL-C、1,25-(OH)2D3比较差异有统计学意义，且aa基因型患者的FPG、HbA1c、Fins水平更高，HDL-C、1,25-(OH)2D3水平更低(F值分别为6.278、5.536、9.663、6.012、11.547，均P<0.05)，见表3。

表3 VDR基因ApaⅠ不同基因型临床生化指标比较

2.5青少年代谢综合征空腹血糖受损的危险因素分析

以MS患者中是否出现空腹血糖受损作为因变量(是为1，否为0)，以Non-IFG亚组及IFG亚组比较差异有统计学意义的因素作为自变量行Logistic回归分析，结果显示，BMI、FPG、HbA1c、HOMA-IR、aa基因型及a等位基因为MS患者空腹血糖受损的危险因素，HDL-C及1,25-(OH)2D3为MS患者空腹血糖受损的保护因素，其OR值及95%CI分别为2.416(1.397～6.222)、2.978(1.694～8.996)、1.896(1.207～7.554)、2.021(1.832～7.449)、2.142(1.214～8.094)、2.423(1.353～7.939)、0.421(0.384～0.852)、0.527(0.436～0.847)，均P<0.05，见表4。

表4 青少年代谢综合征血糖受损的危险因素分析

3讨论

3.1维生素D水平与儿童代谢综合征的关系

维生素D水平与儿童青少年机体钙磷代谢及肥胖发生密切相关。研究显示，儿童青少年血维生素D水平降低与血糖升高、胰岛素抵抗存在相关性，且易导致血压、血脂异常[8]。维生素D在血液循环中主要以25-羟基维生素D的形式存在，在肾脏转化为具有生物活性的1,25-二羟基维生素D。需要指出的是，目前对于维生素D如何影响糖代谢的作用机制尚不明确。现有的研究发现，维生素D可以通过肌肉、肝脏以及胰岛细胞上的维生素D受体调节细胞内钙离子浓度以及对炎症因子的释放产生作用从而直接或者间接影响胰岛素敏感性以及胰岛β细胞功能[9]。通过本研究发现，MS患者IFG亚组血清中1,25-(OH)2D3水平、HOMA-IR，与对照组、无IFG亚组比较差异有统计学意义，提示MS空腹血糖受损患者存在明显的维生素D水平降低和胰岛素抵抗，也进一步阐明了维生素D对于维持胰岛β细胞功能的影响及对血糖的调节作用。

3.2维生素D水平与其受体基因多态性的关系

维生素D水平受到环境、地理位置、季节饮食及遗传等因素的影响，其中遗传因素是重要的影响环节之一[10]。维生素D受体基因多态性与儿童青少年维生素D水平已经成为研究的热点，而维生素D受体基因位点研究热点主要集中在FokⅠ、BsmⅠ、TaqⅠ等基因位点上[11-12]。但需要指出的是，不同的研究得出的结论不尽相同。国外一项研究显示，维生素D受体基因FokⅠ、BsmⅠ、TaqⅠ位点与维生素D水平无关[13]，但另有研究却显示维生素D受体基因FokⅠ、BsmⅠ、TaqⅠ与维生素D缺乏呈显著相关[14]。不同的研究结果可能与不同的种族、地理环境等因素有关。尽管国外研究显示，不同维生素D基因位点与儿童青少年肥胖、血脂及血压升高乃至胰岛素抵抗均在一定程度上存在相关性[15-16]，但需要指出的是目前国内对于探讨维生素D受体基因多态性青少年代谢综合征患者的关系，尤其是空腹血糖受损之间的关系研究尚少。通过本研究发现，MS组患者各亚组与NC组比较存在维生素D受体基因ApaⅠ基因位点表达差异，经多因素Logistic回归分析显示，aa基因型及a等位基因为MS患者空腹血糖受损的危险因素，说明青少年代谢综合征患者维生素D受体基因多态性与空腹血糖受损存在相关性，临床需要密切关注维生素D受体基因多态性与青少年代谢综合征疾病之间的关系。

3.3维生素D及其受体基因多态性与远期心血管事件的关系

维生素D水平与MS患者及远期心血管事件有着一定关系，影响维生素D水平的因素很多，如饮食习惯、地理环境、遗传等[17]。目前，国内对于这一关系的研究尚缺乏足够的证据。通过本研究发现，aa基因型患者维生素D水平明显低于AA基因型、Aa基因型，多因素Logistic回归分析显示维生素D水平是影响MS患者空腹血糖受损的影响因素。因此，笔者认为，一是aa基因型患者可能通过降低维生素D水平导致MS患者空腹血糖受损，因此建议临床治疗MS时需调整治疗方案，适当加入维生素D制剂；二是需要进一步深入研究维生素D受体基因影响空腹血糖受损的机制，以进一步阐明维生素D在MS及糖尿病中的发生机制。

综上，维生素D受体基因ApaⅠ位点多态性与MS患者空腹血糖受损存在一定相关性，其可能通过降低维生素D受体水平引起MS空腹血糖受损。