桐油中脂肪酸组成特征图谱的构建和分析

易金生，迟韵阳，吴巧花，代丽华，吴妹杰，贺义昌★

（1.宜春市袁州区国有林场，江西 宜春 336000；2.江西省林业科学院，江西 南昌 330013；3.江西省林业科技实验中心，江西 信丰 341608）

油桐（Vernicia fordii）为大戟科油桐属植物，是中国四大木本油料植物之一，广泛分布于我国陕西、河南、江苏、安徽、浙江、江西、福建、台湾、湖南、湖北、广东、海南、广西、四川、贵州、云南等省区[1-2]。油桐也是江西的乡土树种，广泛分布于各个县市。油桐主要分为三年桐和千年桐，油桐最主要的经济价值是油桐种子榨取的油——桐油，其色泽呈金黄色或棕黄色，是一种优良的干性油，具有强附着力、强防腐性、强耐冷热性、强密封性、强绝缘性等特点，广泛用于制造业、农业、航空、渔业、医药等领域[3-10]。

桐油的主要成分为α-酮酸、油酸、亚油酸、硬脂酸、棕榈酸等，其组成比例对桐油的品质具有决定性作用，因此，桐油中脂肪酸组成的分析检测对桐油的品质筛选和质量监控具有重要的现实意义[11-12]。桐油脂肪酸含量的测定主要有紫外可见分光光度法（UV）和气相色谱质谱法（;C/MS）等。紫外可见分光光度法由于油中不皂化物会对检测结果产生较大影响，应用较少；气相色谱质谱法由于其灵敏度高、分离效能高效，是目前脂肪酸分析的主流方法[13-15]。王发松等[16]采用;C/MS联用技术分析了来凤金丝桐中脂肪酸组成，其还在桐油中发现α-桐酸在内的5种顺反异构体。傅伟昌等[17]采用2-氨基-2-甲基丙醇衍生化，;C/MS法分析桐油的脂肪酸组成，从桐油中共检测出3.41%的软脂酸、3.71%的硬脂酸、7.07%的油酸、7.51%的亚油酸、1.31%的亚麻酸、73.19%的十八碳共轭三烯酸以及3.80%未鉴定出成分。陈陶静等[18]运用气质联用技术分析了不同产地不同季节桐油的主要成分，结果表明产地和气候对桐油中桐油酸含量均会产生影响，不同品种的油桐种子脂肪酸组成差异明显。综上所述，桐油脂肪酸特征图谱的构建鲜见报道。

本研究采用相似度分析法、聚类分析法和主成分分析法对桐油的脂肪酸组成数据进行分析，生成脂肪酸标准特征图谱，以期为桐油的品质评价、筛选和质量监控提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

油桐果实于2020年10月下旬分别采自江西省林业科学院高安基地，共采集样本23份，样品编号如表1所示。

表1 油桐样品信息Tab.1 Sample information table of Vernicia fordii abel

丁酸甲酯、己酸甲酯、棕榈酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯等标准品（纯度均为10 mg·mL-1，sigma-Aldrich有限公司）；氢氧化钾优级纯（上海国药集团有限公司）；正庚烷色谱纯（西陇科学股份有限公司）；甲醇色谱纯（上海国药集团有限公司）；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

FA2004电子天平（上海良平仪器仪表有限公司），HHS.11-6数显电热恒温水浴锅（上海博讯实业有限公司），HEI-VID旋转蒸发仪（德国海道夫科技有限公司），SHZ-D（Ⅲ）循环泵（巩义市予华仪器有限公司），MX-S涡旋仪（上海赛洛捷克科技有限公司），;C2010-Plus气相色谱仪（日本岛津仪器公司配自动进样器和氢火焰离子检测器FID）。

1.3 实验方法

1.3.1 桐油的提取

桐油提取参考王召滢等[19]的方法，采用索氏提取法提取桐油，油桐籽晒干，剥去外壳，粉碎后，准确称量2～5 g油桐果仁粉末，精确到万分之一，置入滤纸筒内，包装好固定，将滤纸筒置入索氏提取器中，连接平底烧瓶，加入石油醚完成第一次虹吸，再加入少量石油醚浸没滤纸筒，连接冷凝管，浸泡12 h，打开冷凝水，调节水浴锅温度在85℃左右，加热回流4～6 h，停止加热，冷却至室温，倒出提取器中的液体合并到平底烧瓶中，回收石油醚。将平底烧瓶在90℃烘箱中烘1 h后，趁热将桐油转移到离心管中备用。

1.3.2 桐油脂肪酸组分测定

甲酯化方法在国家标准方法的基础上进行优化后使用，具体流程如下：在甲酯化之前，把桐油置于60℃水浴锅上加热，取桐油约60～100 mg（2滴）置于10 mL离心管中，加入4 mL正庚烷，涡旋均匀，随后加入250μL 1 mol·L-1的氢氧化钾甲醇溶液（该溶液需要经过无水硫酸钠除去水分），猛烈震荡1 min，静置0.5 h，再加入1～2 g硫酸氢钠，猛烈震荡1 min，静置0.5 h后，移取0.5～1.2 mL转移至自动进样瓶，放置气相色谱自动进样盘中等待测定。

脂肪酸组成的数据采集方法为：色谱柱为SHRTX-2560（0.2μm×0.25 mm×100 m），载气为氮气，进样口温度230℃，检测器温度250℃，氢气流量为30 mL·min-1，空气流量为400 mL·min-1，载气流速为0.60 mL·min-1，分流比是30∶1，程序升温是150℃(保留8 min)250℃(保留30 min)，进样量为2 μL。

1.4 数据处理与分析

各脂肪酸组成含量采用校正面积归一法进行计算，脂肪酸特征图谱构建及其相似度计算采用中药指纹图谱相似度评价系统2012A版和2012B版进行处理，脂肪酸组成数据的聚类分析和主成分分析(PCA)利用Excel办公软件分析。

2 结果与分析

2.1 桐油标准特征图谱的构建及相似度计算

如图1所示，桐油脂肪酸标准特征图谱的建立，首先将;C中采集到的桐油数据与脂肪酸标准图谱数据进行积分处理，导入中药特征图谱相似度评价系统2012A版中，生成桐油脂肪酸标准特征图谱。桐油脂肪酸组成标准特征图谱脂肪酸含量如表2所示，桐油脂肪酸含量最高的为α-桐酸（C18∶3n3c），达到66.156%；其次是油酸（C18∶2n6c）和β-桐酸（C18∶3n3t），含量分别为7.697%和7.513%。

图1 桐油脂肪酸组成标准特征图谱Fig.1 Standard specific chromatogram of fatty acid composition of V.fordii oil

表2 桐油油脂组成及其对应标准特征图谱脂肪酸的数值Tab.2 Content of fatty acids in V.fordii oil by standard specific chromatogram

如图2所示，不同家系桐油特征图谱的对比图是通过中药色谱特征图谱相似度评价系统2012B版软件得到的，通过对比分析得出比较图谱，经过比较图谱结果可知，不同家系桐油脂肪酸组成成分类似，没有明显差异。

根据色谱特征图谱实验研究技术指南可以判定，当相似度大于90%以上时，表明符合脂肪酸组成相似度的评判标准，当相似度小于90%时，表明此特征图谱不符合评判标准。由表3可知，不同家系桐油特征图谱相似度差异并不显著，相似度均达到90%以上，显而易见，与图2结果一致，说明桐油标准特征图谱的建立符合该样品的整体性。

表3 不同家系桐油样品及其相似度Tab.3 Similarity of sample of differents V.fordii oil

图2 不同家系桐油特征图谱的对比Fig.2 Comparison of specific chromatogram of differents V.fordii oil

2.2 桐油样品脂肪酸数据聚类分析

如图3所示，23个不同家系桐油样品的聚类分析是运用Excel软件进行分析，分析方法采用组间连接法。由结果可知，油桐S7、S8、S1、S13、S20、S10和S21样品与其他油桐样品差异性明显，其余油桐样品之间差异不明显。当设置阈值为10.0时，样品可分为3类，即g1（油桐S7、S8、S1、S13、S20、S10、S21）、g2（油桐S16、S18、S17、S11、S12、S15）和g3（其他）。

图3 油桐样品油脂聚类谱系图Fig.3 Cluster spectrum of fatty acids composition in V.fordii samples

2.3 桐油样品脂肪酸数据主成分分析

通过与脂肪酸标准品比对，从桐油24个样品中共鉴定出11个共有脂肪酸，分别为C4∶0（丁酸）、C6∶0（己酸）、C16∶0（棕榈酸）、C18∶0（硬脂酸）、C18∶1n9c（油酸）、C18∶2n6c（亚油酸）、C20∶0（花生酸）、C20∶1（花生一烯酸）、C18∶3n3c（α-桐酸）、C24∶1（顺-15-二十四碳一烯酸甲酯）和C18∶3n3t（β-桐酸）。将23个不同家系桐油样品中11种共有脂肪酸进行PCA标准化处理，计算相关矩阵的特征值和特征向量，从而得到桐油样品各脂肪酸组成的主成分特征值和方差贡献率（见表4）。

表4 桐油各脂肪酸组成PCA的特征值及方差贡献率分析结果Tab.4 The result of Characteristic value and variance contribution rate of PCA of fatty acids in V.fordii oil

主成分载荷矩阵是由Kaiser标准化的正交旋转后得到的，主成分与对应变量的相关性可以由得分系数矩阵表示，从而得到桐油脂肪酸组成主成分表达式，如下所示：

从以上主成分表达式和表4可以得出，前4个主成分累计贡献率为87.180%(＞80%)，代表着整个家系的桐油样品中脂肪酸含量87.180%以上的信息。其中，贡献率最高的是第一主成分A1，其值为27.889%，对应变量花生一烯酸、α-桐酸、β-桐酸和顺-15-二十四碳一烯酸甲酯具有较高的载荷系数，因此它们与A1有很高的相关性；同样可以得出，棕榈酸、硬脂酸和二十碳酸与A2有高的相关性；油酸和亚油酸与A3有高的相关；丁酸和己酸与A4有高的相关性。A1、A2、A3和A4可代表桐油脂肪酸组成主要含量，并且准确可靠。

3 结论

本研究采用气相色谱法采集了24份不同家系桐油的脂肪酸特征图谱，从桐油中共检测出11种脂肪酸，分别为C4∶0、C6∶0、C16∶0、C18∶0、C18∶1n9c、C18∶2n6c、C20∶0、C20∶1、α-酮酸、C24∶1和β-酮酸，不同家系桐油的相似度极高，都达到90%以上，说明桐油的标准图谱符合该样品的整体性；通过结合聚类分析和主成分分析，评价桐油的标准特征图谱信息和相似度，结果表明所建立的桐油标准特征图谱能从化学成分的整体特征方面代表桐油的脂肪酸组成信息，此研究结果可为桐油品质评价及质量监控提供有力的理论依据，具有实际应用价值。