降压宝蓝片对自发性高血压大鼠血管重构的影响❋

周红艳， 孙江伟， 张 薇， 杨 丹， 王 军△

(1.河南省中医药研究院中药药理实验室， 郑州 450004；2.河南省省立医院药学部， 郑州 450019)

高血压病是一种常见的心血管疾病，严重威胁着人类的生命健康。高血压与血管重构(vascular remodeling, VR)密切相关。VR是高血压所致的病理变化及心、脑、肾等靶器官损害的病理基础[1，2]。高血压的防治已从传统的局限于降低血压转向通过改善血管重构从而减轻靶器官损伤及降低并发症。降压宝蓝片是河南省中医药研究院高血压中心系列医院制剂之一，临床疗效确切，具有降压及心、脑、肾靶器官保护作用[3]。阳性药马来酸依那普利片为临床常用降压药物，属于血管紧张素转化酶抑制剂的一种，用于治疗原发性高血压。本实验选用最接近人类原发性高血压病理生理过程的自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats, SHR)为实验对象，以其遗传母体京都wistar大鼠(wistar-kyoto，WKY)作对照，通过对胸主动脉病理形态、中膜厚度、胶原蛋白及弹力纤维的观察，研究降压宝蓝片对高血压性VR的影响；通过检测血清血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ, AngⅡ)、缓激肽(bradykinin，BK)和一氧化氮(nitric oxide, NO)含量，初步探讨降压宝蓝片预防与逆转高血压VR的病理生理机制。本研究已通过河南省中医药研究院动物伦理委员会批准，批准号HNTCMDW-20150316-002。

1 材料

1.1 动物

SPF级雄性SHR大鼠30只，12周龄，SPF级雄性WKY大鼠10只，12周龄，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物许可证号SCXK(京)2015-0001，实验动物合格证号1150060133361。饲养于河南省中医药研究院实验动物中心SPF级动物实验室，实验单位使用许可证号SYXK(豫)2019-0001，饲养环境温度(24±1)℃，相对湿度(60±10)%，光照周期12 h/12 h明暗交替，普通饮食，自由饮水。

1.2 药物

降压宝蓝片，由河南省中医药研究院附属医院制剂室提供，批号20150713。在前期的主要药效学研究中，共进行了3个剂量(1.2 g·kg-1、0.6 g·kg-1、0.3 g·kg-1)降压和降脂实验。本实验选择其中1个有效剂量(0.6 g·kg-1)进行靶器官保护作用机制研究[3]。马来酸依那普利片(江苏制药股份有限公司，批号15061002，国药准字H32026567，每片10 mg)。

1.3 试剂及仪器

HE染色试剂盒(批号325E038)，北京索莱宝科技有限公司；Gomori染色试剂盒(批号15102340116)，南京森贝伽生物科技有限公司；大鼠BK ELISA检测试剂盒(批号E20160301A)，江苏卡尔文生物科技有限公司；NO试剂盒(批号20160323)，南京建成生物工程研究所；Masson染色试剂盒(批号1508178004)，福州迈新生物技术有限公司。

Synergy NEO型多功能酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)；Asp-303型自动脱水机、EG-1250C型组织包埋机、RM-2135型石蜡切片机、DM4000型光学显微镜、QWin V3图像分析系统(德国Leica公司)。

2 方法

2.1 分组与给药

SHR随机分为模型组、依那普利组(0.02 g·kg-1)、降压宝蓝片组(0.6 g·kg-1)每组各10只，另设10只WKY大鼠为空白组。灌胃给药，给药体积10 ml/kg-1d-1，连续12周。空白组和模型组给予等体积0.5% 羧甲基纤维素钠(carboxymethyl cellulose，CMC)。

2.2 观察指标

末次灌胃给药1 h后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(0.3 g·kg-1)，腹主动脉取血，800×g离心15 min分离血清备用；剪取主动脉弓以下约0.5 cm长的胸主动脉，10%甲醛固定、石蜡包埋、切片备用。

2.2.1 主动脉壁病理形态观察 (1) 中膜厚度测定。苏木素-伊红(HE)染色：切片经苏木素染色5 min，放入酸水及氨水中分色各15 s，酒精伊红染色2 min，系列酒精脱水，二甲苯透明、封片。光镜下观察胸主动脉病理形态学变化；取4处血管环在周向相互垂直位置包含血管壁中膜区域的HE染色切片，病理图像分析系统高倍镜下(×400)测量中膜厚度(media thickness，MT)并计算平均值。

(2) 主动脉中膜胶原蛋白容积分数(collagen volume fraction，CVF)测定。胶原蛋白Masson染色：切片置于复合Masson染色溶液中5 min，0.2%乙酸溶液洗涤30 s，1%磷钼酸溶液分化5 min，亮绿液染色5 min，1%冰醋酸溶液浸洗片刻，无水酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片；病理图像分析系统高倍镜下(×400)测量胶原蛋白染色面积(collagen staining area，CA)和中膜总面积(total area of media，TA)，取平均值并计算主动脉中膜胶原蛋白容积分数(collagen volume fraction，CVF)。

CVF=CA/TA×100%。

(3) 主动脉中膜弹力纤维容积分数(elastin volume fraction，EVF)测定。弹力纤维Gomori醛品红染色：切片经Lugol碘液及5%硫代硫酸钠处理各5 min，水洗，70%乙醇稍浸洗2下，醛品红液染色10 min，70%乙醇浸洗2次，每次约30 s立即水洗，桔黄G复染1 s，水洗，95%乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片；病理图像分析系统高倍镜下(×400)测量中膜选定区域内的弹力纤维面积(elastic fiber area，EA)和(TA)，取平均值并计算主动脉中膜弹力纤维容积分数(elastin volume fraction，EVF)：EVF=EA/TA×100%。

2.2.2 血清AngⅡ和BK含量测定 取血清按ELISA试剂盒说明书操作，用酶标仪于450 nm波长处分别测定AngⅡ和BK样品吸光度(A)，根据标准曲线方程计算各样品含量。

2.2.3 血清NO含量测定 取血清100 μl，按微板法试剂盒说明书操作，用酶标仪于550 nm处测NO样品吸光度(A)，计算NO含量。

2.3 统计学方法

3 结果

3.1 降压宝蓝片对SHR胸主动脉MT、CVF和EVF的影响

表1～3示，空白组大鼠胸主动脉血管壁内三层分界明显，无明显增厚，中膜平滑肌细胞核蓝染，弹力膜分层清晰，无排列紊乱现象，可见少量胶原蛋白染色。与空白组比较，模型组大鼠中膜单位面积细胞核数量明显增多，MT明显增厚 (P<0.01)，部分出现内膜损伤及外膜炎性细胞浸润现象；Masson染色可见大量深染的胶原蛋白沉积，CVF显著升高(P<0.01)；Gomori醛品红染色可见，VSMC及弹力膜排列紊乱，EVF明显降低(P<0.01)。降压宝蓝片组和依那普利组SHR主动脉组织病理形态学明显改善；与SHR对照组比较，MT、CVF明显降低(P<0.01)，EVF显著升高(P<0.01)。

表1 降压宝蓝片对SHR胸主动脉MT、CVF和EVF影响比较

注：A. 空白组；B. 模型组；C. 依那普利组；D. 降压宝蓝片组图1 胸主动脉组织形态学改变比较(HE染色×400)

注：A. 空白组；B. 模型组；C. 依那普利组；D. 降压宝蓝片组图2 胸主动脉中膜胶原蛋白改变比较(Masson染色×400)

注：A. 空白组；B. 模型组；C. 依那普利组；D. 降压宝蓝片组图3 胸主动脉中膜弹力纤维改变比较(Gomori醛品红染色×400)

3.2 降压宝蓝片对SHR血清AngⅡ、BK及NO含量的影响

表2示，与空白组比较，模型组大鼠血清BK含量显著降低(P<0.05)，NO含量具有降低的趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)，AngⅡ含量无明显变化。降压宝蓝片及依那普利均能显著升高SHR血清BK及NO含量(P<0.05～0.01)；对AngⅡ有降低的趋势，但无统计学意义(P>0.05)。

表2 降压宝蓝片对SHR血清AngⅡ、BK和NO的影响

4 讨论

高血压导致的VR以血管张力改变为特征，长期血压升高致使血管壁压力负荷，顺应性降低，血管壁中层增厚，胶原纤维增生，血管管腔狭窄，血流阻力增高，引起重构并加重靶器官损伤及并发症的出现。本研究结果显示，24周龄SHR对照组出现胸主动脉中膜增厚，平滑肌细胞核增多，内膜内皮细胞损伤及外膜炎性细胞浸润等病理变化，可见大量深染的胶原蛋白沉积，平滑肌细胞及弹力膜排列紊乱，CVF显著升高，EVF明显降低，符合高血压血管重构改变。与文献报道结果一致[4，5]。降压宝蓝片能明显减轻主动脉病理性改变和中膜胶原蛋白沉积，改善主动脉中膜弹力纤维病理形态，显著降低SHR胸主动脉MT和CVF，明显升高EVF，说明降压宝蓝片具有改善高血压血管重构的作用。

以往研究结果显示，肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system, RAS)可影响血管重构[6]，RAS由肾素、血管紧张素(an-giotension, Ang)、血管紧张素转化酶(angiotensincon-vertingenzyme, ACE)组成，肾素作用于Ang并使Ang酶解AngⅠ，AngⅠ在ACE的作用下形成AngⅡ，AngⅡ具有很高的生物活性，能促进大量细胞因子及活性物质分泌，如血管内皮生长因子、转化生长因子、金属蛋白酶等，引起胞外基质的沉积及转化，导致中膜平滑肌细胞增殖并迁移至内膜下增生，从而引起内皮细胞功能失调和血管炎性改变及血管重构的发生[7-9]；AngⅡ还可使内皮细胞合成的NO迅速灭活，打破NO维持的血管正常构型，从而削弱其抑制血管重构的作用。前期研究发现，降压宝蓝片含药血清可抑制血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞增殖和迁移[10]。本研究结果显示，各组大鼠血清AngⅡ含量无显著差异，降压宝蓝片对血清AngⅡ含量较模型组有降低趋势，但差异无统计学意义。有研究提示，高血压及其靶器官损害与局部AngⅡ含量呈明显正相关，与循环AngⅡ含量无显著相关[11]。由于本次实验未测定SHR胸主动脉中AngⅡ含量，降压宝蓝片改善血管重构的作用是否与降低胸主动脉中AngⅡ含量有关，有待进一步验证。激肽释放酶-激肽系统(kallikrein kinin system，KKS)是体内重要的心血管保护因子，对RAS起重要的平衡作用，如调节血压、抑制心肌肥厚的形成、减少缺血再灌注损伤等[12，13]。BK是KKS中的一种重要的活性物质，BK作用于血管内皮细胞膜缓激肽受体，使其释放组织纤溶酶原激活物、NO和前列腺素I2等，弥散至血管平滑肌细胞，通过一系列机制引起血管舒张效应[14]。此外，BK亦可通过舒张肾入球小动脉，增加肾小球滤过率而起降压作用[15]。本研究结果显示，SHR对照组血清BK含量显著降低，降压宝蓝片能明显升高血清中BK含量，促进内皮细胞释放NO，通过扩张小动脉增加组织血流量，抑制平滑肌细胞增殖，发挥舒张血管效应，改善血管重构。

降压宝蓝片前期动物实验研究发现，降压宝蓝片对SHR左室肥厚病理形态学有明显改变，具有逆转高血压左室肥厚及左室重构的作用；对SHR收缩压、舒张压和平均动脉压有不同程度的降低作用，但与模型组比较差异无统计学意义，且降压程度明显低于阳性对照药依那普利[3]。本次实验每周进行一次无创尾动脉血压测定，发现降压宝蓝片对SHR血压的影响与前期研究结果一致，本文未做详析。

随着高血压患病人数的增多，中医药在防治高血压及其靶器官损害方面发挥着越来越重要的作用。本研究结果显示，降压宝蓝片能显著降低SHR胸主动脉MT和CVF，明显升高血清BK、NO含量及主动脉EVF。提示降压宝蓝片具有非降压依赖性改善高血压血管重构的作用，部分作用机制可能与调节RAS/KKS平衡有关。