柴芩通淋片对临床分离大肠埃希菌的耐药逆转作用❋

周金鹤， 杨伟峰， 王 毅， 童 倩， 何忠梅△

(1.吉林农业大学中药材学院， 长春 130118；2.中国中医科学院医学实验中心， 北京 100700；3.湖北工业大学， 武汉 430068)

泌尿系统感染(urinary tract infection，UTI )是指病原体侵入泌尿系统生长繁殖引起的炎症反应所致的急、慢性疾病，包括尿道炎(urethritis )、膀胱炎(cystitis)、肾盂肾炎(pyelonephritis)等。临床引起泌尿感染致病菌主要为大肠埃希菌(Escherichiacoli，EColi)、肺炎克雷伯菌(KlebsiellaPneumoniae，Kpn)、阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae，Ecl)和铜绿假单胞菌(P.Aeruginosa，P.a)等，其中大肠埃希菌最为常见，占临床检出率的40%-80%[1，2]。临床治疗泌尿系统感染以氟喹诺酮类、头孢菌素、碳青霉烯类等抗生素控制感染为主[3，4]，但众所周知，抗菌药物的广泛、持续和不当使用，会改变细菌的生存环境带来选择性压力，在这种抗生素压力诱导下，病原菌可通过多种机制产生对抗生素的耐药性。在面对日趋复杂、高发的细菌耐药性问题时，抗生素作用就愈发有限甚至无效。

中医药在感染性疾病防治方面有其独特的理论体系及丰富的临床实践，通过抗菌、增强机体免疫能力等多种途径发挥作用[5，6]，成为临床解决耐药菌感染的有效手段。柴芩通淋片(chaiqintonglin,CQTL)由柴胡、黄芩、萹蓄、瞿麦、车前子、苦参、乌药、地黄、大黄、川牛膝组成，临床主要用于泌尿系统感染，效果良好。前期实验研究表明，CQTL可显著降低泌尿道感染模型小鼠膀胱和肾脏的大肠杆菌菌落形成数,缓解肾脏炎症反应[7]，对慢性非细菌性前列腺炎大鼠也具有良好的治疗效果[8]。但在整个用药过程中，中药CQTL是否与抗生素一样会对细菌产生诱导耐药作用，尤其对已耐药的细菌会产生怎样的影响尚不得而知。本研究拟通过一系列体外实验，明确中药CQTL对细菌耐药特性的影响。

1 材料

1.1 菌株

大肠埃希菌质控菌株(ATCC29522)，购自美国ATCC标准库；大肠埃希菌临床分离菌株(编号E5A2、E5A4、E5A6、E5A7、E5A11、E5A12、E5B2、E5B4、E5E5、E5E7、E4C3、 E4C8、E4C12、E4B4、E4B5、E4B6、E6B2、E6B3、E6B4、E6B5)，由中国中医科学院广安门医院检验科提供。

1.2 药物及试剂

柴芩通淋片(CQTL)(石家庄以岭药业股份有限公司，批号A1412001)；TTC(美国Sigma公司，批号17779-10)；胰蛋白胨(OXOID，货号LP0042)；酵母提取物(OXOID，货号LP0021)；琼脂粉(Sigma，S-A1296)；头孢吡肟(cefepime，FEP 中国食品药品检定研究院，货号130524)；头孢噻肟(cefotaxime sodium，CTX，中国食品药品检定研究院，货号130483)；头孢呋辛(cefuroxim，CXM，中国食品药品检定研究院，货号C11065300)；头孢哌酮(cefoperazone，CFP，中国食品药品检定研究院，货号C0684750)；头孢他啶(ceftazidime，CAZ，中国食品药品检定研究院，货号C0690500)；头孢西丁(cefoxitin，FOX，中国食品药品检定研究院，货号C0688000)；氨苄西林(ampicillin，AMP，中国食品药品检定研究院，货号1033000)；环丙沙星(ciprofloxacin，CIP，中国食品药品检定研究院，货号1134313)；左氧氟沙星(levofloxacin，LVX，中国食品药品检定研究院，货号C14629730)；庆大霉素(gentamicin，CN，中国食品药品检定研究院，货号130326)；阿米卡星(amikacin，AK，中国食品药品检定研究院，货号1019508)；替加环素(tigecycline，TGC，中国食品药品检定研究院，货号1667643)；磺胺甲恶唑(sulfamethoxazole，SMZ，中国食品药品检定研究院，货号C16998100)；呋喃妥因(furantoin，F，中国食品药品检定研究院，货号C15570900)；美罗培南(meropenem，MEM，中国食品药品检定研究院，货号1392454)；氨曲南(aztreonam，ATM，中国食品药品检定研究院，货号130507)。

SW-CJ-1FD型超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；THZ-D型恒温振荡培养箱(苏州培英实验设备有限公司)；KBF-240型恒温培养箱(BINDER)；V-1100型紫外分光光度计(上海美普达仪器有限公司)，MLS-3750高压灭菌锅(日本三洋)。

2 方法

2.1 CQTL母液的配制

LB培养基(1 L)：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl10 g，pH7.4～7.6(LB固体培养基加2%琼脂)，高压灭菌，4 ℃冰箱保存备用。

CQTL母液：精密称取CQTL干燥粉加入适量细菌培养基(LB)，充分溶解使其终浓度为0.48 g生药量/mL，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，4 ℃冰箱保存备用。

2.2 药敏检测

参照CLSI推荐的微量肉汤稀释法，分别测定CQTL及16种抗生素(FEP、CTX、CXM、CFP、CAZ、FOX、AMP、CIP、LVX、CN、AK、TGC、SMZ、F、MEM、ATM)对20株临床耐药大肠埃希菌的最低抑菌浓度(MIC)，实验重复3次并记录结果。

2.3 CQTL连续培养对20株临床分离大肠埃希菌抗生素敏感性的影响

挑取20株耐药大肠埃希菌单菌落于3～5 mL LB肉汤培养基中，280rpm、37 ℃恒温震荡培养16～18 h，测定其吸光度A600 nm为0.2(约1×107CFU)备用。CQTL浓度根据2.2实验结果选择1/4 MIC。将稀释菌液与CQTL稀释药液1∶1混匀(V:V=1∶1)，280rpm、37 ℃条件的恒温震荡培养箱中培养16～18 h，涂布菌液于LB固体培养基，37 ℃条件的恒温恒湿培养箱生长(16-18 h)保存菌落，一代记作T1，重复以上操作至5代，分别记为T2-T5，原代菌株则记为T0。对CQTL连续培养获得的5代大肠埃希菌(T1-T5)分别检测其对16种抗生素(FEP、CTX、CXM、CFP、CAZ、FOX、AMP、CIP、LVX、CN、AK、TGC、SMZ、F、MEM、ATM)的MIC值，实验重复3次并记录结果。每组随机选择10个接种于LB琼脂平板的T0-T5菌株单菌落，Image J 8.0软件测量直径进行比较。

2.4 细菌耐药特性改变后的遗传稳定性研究

对2.3实验中经1/4 MIC浓度CQTL连续培养发生抗生素敏感性改变的菌株进行连续空白培养至10代，分别记为C1-C10，对获得的C1-C10菌株分别进行抗生素MIC值检测，以确定抗生素敏感性改变能否稳定遗传。

2.5 统计学方法

3 结果

3.1 药敏结果

表1示，20株临床分离大肠埃希菌对16种抗生素(头孢类、青霉素类、氨基糖苷类、喹诺酮类、磺胺类及人工合成抗生素)MIC值进行检测。表1示，20株临床分离大肠埃希菌均为多耐药大肠埃希菌，对头孢类、氨基糖苷类、喹诺酮类基本多数表现为耐药，FOX、F多数表现为药物敏感性适中，MEM因临床使用较少，基本表现为药物敏感。

表1 20株临床分离大肠埃希菌对16种抗生素最低抑菌浓度检测结果比较(μg/ml)

表2示，CQTL对20株临床分离耐药大肠埃希菌MIC值进行检测。CQTL在0.24 g/mL浓度时对20株临床分离耐药大肠埃希菌中的9株细菌(E5A2、E5A11、E5B5、E4B6、E5A4、E5A7、E5B4、E5E5、E4C8)可产生抑菌作用，其MIC值均为0.24 g/mL，结果提示较高浓度的CQTL对部分临床分离的耐药大肠埃希菌有抑菌作用。

表2 柴芩通淋片对20株临床分离大肠埃希菌的最低抑菌浓度检测结果(g/mL)

3.2 CQTL提取物对耐药大肠埃希菌抗生素敏感性的影响

图1示，细菌经过1/4 MIC浓度CQTL连续作用后，部分菌株形态发生改变。以E4B5菌株为例，原代菌株及CQTL连续作用5次后的菌株形态，E4B5原耐药菌株菌落明显较干瘪，经过CQTL连续作用后的菌株菌落变得更加圆滑、饱满。图2示，Image J 8.0软件T0-T5菌株单菌落直径测量结果，E4B5原耐药菌株菌落明显较小，经过CQTL连续作用后的菌株菌落直径显著增大，与T0组比较差异有统计学意义(P<0.01，P<0.05)。表3示，对1/4 MIC浓度CQTL连续作用后的菌株进行16种抗生素敏感性检测发现，20株临床分离耐药菌株中有3株菌出现对CAZ敏感性降低。在经过1/4 MIC浓度CQTL连续作用后，E4B5、E5E7菌株对CAZ的MIC值分别由最初的256 μg/ml、2048 μg/ml降至32 μg/ml，E5A4在经过1/4 MIC浓度CQTL连续作用后的第1代和第2代菌株MIC值恢复为8 μg/ml，后面连续培养后对CAZ的敏感性又有所变化，20株临床分离大肠埃希菌对其他抗生素未表现出明显变化。结果表明，在1/4 MIC浓度CQTL连续作用后对部分临床分离耐药大肠埃希菌抗生素敏感性有所降低，提示CQTL具有一定的诱导细菌耐药逆转的作用。

注：A.E4B5原菌株；B.1/4MIC浓度柴芩通淋片作用1次；C.1/4MIC浓度柴芩通淋片作用2次；D.1/4MIC浓度柴芩通淋片作用3次；E.1/4MIC浓度柴芩通淋片作用4次；F.1/4MIC浓度柴芩通淋片作用5次图1 E4B5原菌株及柴芩通淋片连续5次用药后细菌形态变化比较

注：T0.为原代菌株；T1-T5.为柴芩通淋片连续作用1-5代；n=10,与T0组比较：**P<0.01，*P<0.05图2 E4B5原菌株及连续5次用药后单菌落直径(mm)

表3 1/4MIC浓度柴芩通淋片连续作用后临床分离大肠埃希菌对头孢他啶最低抑菌浓度变化比较(μg/ml)

3.3 细菌耐药性恢复遗传稳定性研究

表4示，对经1/4 MIC浓度CQTL连续用药5次后恢复CAZ药物敏感性的菌株进行连续空白培养传代至10代后抗生素MIC值测定结果示；与经CQTL逆转后5代的菌株比较，空白培养10代后的菌株其头孢他啶MIC值几乎无变化，提示细菌对CAZ敏感性的恢复可稳定遗传并具有遗传稳定性。

表4 柴芩通淋片用药5次与空白培养10次大肠埃希菌对头孢他啶最低抑菌浓度比较(μg/ml)

4 讨论

CQTL由柴胡、黄芩、萹蓄、瞿麦、车前子、苦参、乌药、地黄、大黄、川牛膝组成。君药柴胡、黄芩相须为用，用以温热膀胱、疏解肝经气滞。臣药萹蓄、瞿麦、车前子配伍利水通淋，清肝热通膀胱，助君药清泻肝经及下焦湿热。佐药苦参清热燥湿；乌药助柴胡疏肝解郁，调经止痛；生地黄防热伤血瘀；大黄泄热降火；牛膝利尿下行、助利水通淋之效；诸药合用[8]疏郁滞之气，除下焦、膀胱之湿热，使清浊分、湿热去、小便清、疼痛止。本研究首先对获得的20株临床分离大肠埃希菌进行抗生素敏感性检测，结果显示20株临床分离的大肠埃希菌对FOX、MEM、LVX、F、TGC相对药物敏感；对FEP、CTX、CFP、CXM耐药率达到90%以上，与顾丽娜、余建洪[9，10]等报道基本相符。20株临床分离大肠埃希菌皆为MDR菌株，提示抗生素的广泛、持续使用可极大程度上诱导细菌耐药性的产生。沈才宏、王卉[11，12]等研究报道，CTX对泌尿系感染效果较好，而本实验中20株临床分离大肠埃希菌对CTX的耐药率很高，这可能与临床CTX为治疗感染的推荐药物有关[3]。实验中CQTL对20株菌中的9株多重耐药菌株有抑菌作用，CQTL的MIC值为0.24 g/mL，远高于临床常用抗生素，可能受体外实验药材提取制备方法限制，全方中部分有效组分丢失导致。

研究表明，柴胡地上部分中所含的挥发油可显著抑制金葡菌、大肠埃希菌、表皮葡萄球菌等多种细菌[13，14]；柴胡水提物可抑制金葡菌、伤寒杆菌，但对大肠埃希菌无抑制作用[15]。黄芩有较强的抑制E.coli作用[16-18]，王娜[19]观察到黄芩有效成分黄芩苷对大肠杆菌的MIC为1.56 g/L，且黄芩苷的抑菌能力高于黄芩皂苷。董春雷等[20]发现，500 mg/L黄芩素能抑制46.52%的E.coli浮游菌和45.15%生物膜。郑泽生[21]等研究表明，萹蓄草提取物较低浓度对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌等均有较好的抑菌活性。此外，CQTL方中的瞿麦、地黄、车前子和苦参等也对多种致病菌具有较好的抑菌作用[22-27]。CQTL对除大肠埃希菌外其他菌群如金葡菌、表皮葡萄球菌等都有抑制作用，有助于机体菌群平衡的恢复，对泌尿系感染的恢复也有促进作用。

CAZ作为第三代头孢类抗生素对β-内酰胺酶较稳定，用于革兰氏阴性杆菌所致的败血症、下呼吸系感染、腹腔胆系感染、复杂性尿路感染和严重皮肤软组织感染，在2015版专家共识CAZ作为指南中尿路感染的推荐药物[3]。研究发现，在20株分离的耐药菌中有14株对头孢他啶出现耐药，且药物的MIC值多在64～1024 μg/mL之间，再次提示用药频率增加可导致细菌耐药率的增高[28]。20株临床分离大肠埃希菌中3株耐药菌在经过1/4 MIC浓度CQTL连续诱导后，对CAZ药物敏感性得以恢复，且可稳定遗传，提示CQTL可在一定程度恢复已耐药菌株对抗生素的敏感性。有研究表明，黄芩苷[29]、苦参碱[30]以及柴胡皂苷[31，32]除具有抑制大肠埃希菌活性外，还具有促进大肠埃希菌恢复对药物敏感性的作用，且不易产生耐药性；多数清热解毒类中药如黄连[33]、黄芩、柴胡、连翘、板蓝根、苦参、蒲公英、艾草等都具有消除耐药质粒作用[34]，中药在消除耐药质粒后，细菌恢复药物敏感特性具有稳定遗传的特点。因此我们推测，CQTL中所含的抑菌有效成分也是其促进耐药菌恢复抗生素敏感性的有效成分。而这种不同于传统抗生素的耐药消除作用，可能是中药在感染性疾病治疗中的新机制和优于传统抗生素的独特优势所在。应对当前日趋严重的抗生素耐药问题，新药开发速度远远跟不上细菌耐药速度，中药的耐药消除作用、促进耐药菌抗生素敏感性的恢复，对于临床细菌感染的治疗均具有重要意义。

本研究通过模拟临床用药时间观察亚抑菌浓度下CQTL在连续作用后对细菌耐药特性的影响，发现中药亚抑菌浓度(1/4 MIC)CQTL部分耐药菌抗生素的敏感性有所恢复，尤其对临床常用抗生素CAZ敏感性恢复显著且可稳定遗传，初步阐明中药CQTL在泌尿系统感染疾病治疗中具有独特作用及优势。由于CQTL成分复杂，其耐药消除的机理所在仍有待进一步深入开展。