QuEChERS-液相色谱-四极杆飞行时间质谱法测定毒蘑菇中5种鹅膏肽类毒素

林子豪，罗鼎峰，戚 平，毛新武

（广州市食品检验所，广东广州 511400）

近年来，蘑菇中毒事件在我国常有发生，其致死率高达90%以上[1]，主要由鹅膏肽类毒素引起[2]。鹅膏肽类毒素化学性质稳定，在烹饪过程无法破坏其毒性[3]。按结构分类，鹅膏肽类毒素可分为鹅膏毒肽、鬼笔毒肽和毒伞素3大类[4]，其中鹅膏毒肽主要有α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽和γ-鹅膏毒肽，鬼笔毒肽以羧基二羟鬼笔毒肽和二羟鬼笔毒肽为主。鹅膏肽类毒素进入人体后，如果不及时发现和采取治疗，将会引起肝肾功能衰竭而死亡，因此建立快速准确、灵敏度高的鹅膏肽类毒素分析方法对预防蘑菇中毒和抢救中毒患者具有重要意义。

目前，鹅膏肽类毒素的检测方法以液相色谱串联质谱法[5-7]为主，其样品前处理主要采用固相萃取法[8-10]，但该前处理方法耗费时间较长，不适用于中毒应急检验。QuEChERS净化方法简便快捷，在农兽药残留[11-12]和非法添加物[13-14]检测中有广泛的应用。四极杆飞行时间质谱相比四极杆串联质谱具有更高的分辨率，可以降低样品基质的干扰，进一步提高方法准确性[15]。本实验通过优化前处理方法和仪器条件，建立毒蘑菇中5种鹅膏肽类毒素的液相色谱-四极杆飞行时间质谱分析方法，为食品中毒应急检验提供技术支撑保障。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

甲醇、乙腈，色谱纯，美国Thermo Fisher Scientific公司；0.22 μm聚四氟乙烯滤膜，上海安谱科学仪器有限公司；5种鹅膏肽类毒素购自上海安谱科学仪器有限公司（纯度均≥ 90%）。

Waters Xevo Q-TOF液相色谱-飞行时间质谱仪，美国Waters 公司；旋涡振荡混合器，美国Thermo Fisher Scientific公司；电子天平，德国Sartorius公司；Allegra X-30R冷冻离心机，美国贝克曼库尔特公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配制

准确称取5种鹅膏肽类毒素标准品，用甲醇溶解并定容至10 mL，得到100 μg/mL的标准储备液，于-20 ℃避光保存；分别移取1 mL标准储备液至10 mL容量瓶内，用甲醇定容至刻度，配制成浓度均为1 μg/mL的混合标准中间液。移取适量混合标准中间液，用水配制成浓度为10～200 ng/mL的系列混合标准溶液。

1.2.2 样品前处理

准确称取经粉碎均质处理的样品1.0 g（精确至0.01 g）置于50 mL离心管中，加入10 mL乙腈，于旋涡振荡混合器上涡旋5 min，以10 000 r/min离心5 min；取1 mL上清液置于2 mL离心管中，分别加入25 mg无水硫酸钠和C18净化剂，旋涡1 min后，10 000 r/min离心5 min。吸取1 mL净化液，用水稀释至10 mL，过膜，待测。

1.2.3 实验条件

（1）色谱条件。色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱温：40 ℃；进样体积：5 μL；流速：0.3 mL/min；流动相A为水，流动相B为乙腈；梯度：0～2 min，8%B；2～3 min，8%～40%B；3～5 min，40% ～ 60%B；5～ 7 min，60% ～ 80% B；7～7.1 min，80%～8%B；7.1～10 min，8%B。

（2）质谱条件。离子化模式：ESI+；扫描范围：m/z为50～1 000；电喷雾离子源温度为120 ℃；毛细管电压为3.0 kV；脱溶剂气温度为500 ℃；脱溶剂气流量为800 L/h；锥孔气流量为50 L/h。

2 结果与分析

2.1 仪器条件的优化

由于α-鹅膏毒肽和β-鹅膏毒肽的分子量仅相差1 Da，α-鹅膏毒肽含有约43%的13C同位素，因此这两种毒肽需要在色谱上进行基线分离。考察了乙腈-水和乙腈-0.1%（V/V）甲酸水溶液作为流动相的分离效果，结果发现，α-鹅膏毒肽和β-鹅膏毒肽在以乙腈-0.1%（V/V）甲酸水溶液作为流动相时无法分离，在乙腈-水的条件下分离度较好。在乙腈-水的条件下，比较了5种化合物的[M+H]+和[M+Na]+的母离子信号响应，发现[M+Na]+的信号响应均高于[M+H]+。5种鹅膏多肽的质谱条件见表1，色谱图见图1。

表1 5种鹅膏肽类毒素的质谱条件

图1 5种鹅膏肽类毒素的色谱图

2.2 前处理条件的优化

目前，鹅膏肽类毒素的前处理方法主要采用固相萃取法，耗费时间较长，不适用于中毒应急检验。本实验采用QuEChERS净化方法对提取液进行净化。考察了C18、石墨化炭黑、PSA、无水硫酸钠等4种常用净化剂对目标物的吸附情况（用量均为1 mL提取液加入25 mg净化剂）。由图2可知，PSA和石墨化炭黑对β-鹅膏毒肽和羧基二羟鬼笔毒肽等有较强的吸附，C18和无水硫酸钠对5种鹅膏肽类毒素基本没有吸附。因此，本实验采用C18和无水硫酸钠进行净化。

图2 4种净化剂对5种鹅膏肽类毒素的吸附情况

2.3 方法学验证

5种鹅膏肽类毒素的线性范围、线性方程、相关系数、检出限（S/N=3）见表2。在10～200 ng/mL的范围内，5种鹅膏肽类毒素的相关系数均＞0.99，检出限在0.03～0.36 mg/kg。按照实验步骤，选择蘑菇空白样品，进行低、中、高加标回收试验，每个水平重复6次，结果如表3所示。在2～10 mg/kg的加标水平下，5种鹅膏肽类毒素的加标回收率为90.1%～105.4%，相对标准偏差为0.1%～4.1%。结果表明，该方法满足5种鹅膏肽类毒素的检测需求。

表2 5种鹅膏肽类毒素的线性范围、线性方程、相关系数和检出限

表3 5种鹅膏肽类毒素的回收率和相对标准偏差

3 结论

本实验以乙腈为提取溶剂，结合QuEChERS净化技术，建立了5种鹅膏肽类毒素的液相色谱串联飞行时间质谱分析方法。该方法快速简便，回收率高，能满足定性定量需求，为食品中毒应急检验提供强有力的技术保障。