国内外谷物中多种真菌毒素限量和同步检测标准及方法研究进展

(陈鑫璐 邱 月 张建友 丁玉庭 吕 飞

(浙江工业大学食品科学与工程学院，杭州 310014)

1 谷物真菌毒素概述

1.1 真菌毒素

真菌毒素是真菌产生的有毒次生代谢产物[1]，对肝脏、肾脏、造血系统、免疫系统和生殖系统有严重的毒性，同时还有致癌、致突变、致畸等作用[2，3]。目前已发现了近400种真菌毒素[4]，联合国粮食及农业组织(FAO)估计每年有高达25% 的粮食受到真菌毒素的污染，而实际真菌毒素污染发生率(60%～80%)远高于25%[5，6]。

1.2 谷物中常见真菌毒素

谷物是真菌毒素的主要污染对象之一，谷物中常见的真菌毒素包括黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、伏马菌毒素、呕吐毒素、T-2毒素、HT-2毒素和玉米赤霉烯酮等[2]，其毒性作用主要有致癌、致畸、损害肝肾功能，还具有细胞毒性和胚胎毒性，也会导致皮下出血与皮肤坏死、雌激素综合症等[7]。

1.3 谷物中多种毒素共存情况

谷物在种植、收获、运输及储藏过程中都可能遭受产毒真菌污染，受到污染谷物往往同时含有多种真菌毒素，并易产生复杂的毒性作用[4]。多种真菌毒素共存通常会产生协同毒性增强效应。有研究证实，低于国家食品安全限量标准的脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)、ZEN和黄曲霉毒素B1(AFB1)共存时能造成细胞代谢的严重紊乱[8]。黄曲霉毒素G1(AFG1)、伏马菌素B1(FB1)、OTA以及杂色曲霉毒素(ST)也被发现具有联合肝细胞毒性，其中OTA 与 FB1之间存在中度协同作用[9]。Sobral等[10]研究证实，OTA-DON和AFB1-DON组合对肝、肠上皮细胞均有协同毒性作用。除此之外，OTA和FB1也被证实对肝、肾细胞系中具有协同毒性效应[11]。动物体内研究也发现了类似的毒素间协同效应导致毒性增强的现象，如FB1和AFB1共存时会产生协同肝、肾毒性与致癌作用[12]。真菌毒素种类繁多，其在谷物中的共存情况受到谷物种类、产区、气候等多种条件的影响，相关规律尚不明确；另一方面，对于多种毒素的协同毒性作用，迄今为止仍缺乏系统、有效的评估策略，因此，世界各国尚未对多种毒素共存问题作出明确规定。但大量数据表明，毒素间的协同毒性增强效应会在低于单一毒素限量标准的剂量下对人和动物的健康造成较大威胁，因而必须引起重视。

除不同种类毒素的协同毒性效应外，一些真菌毒素本身具有多种对健康有负面影响的衍生物。研究表明，在某些情况下DON的乙酰化衍生物3A-DON和15A-DON的毒性作用甚至高于其本体[13]，乙酰化的DON在生物体内可全部或部分水解以释放母体糖苷配基转化成DON，潜在地増加了DON摄入量[14]。ZEN及其代谢产物ZOL也被证明均具有雌激素效应，α-ZOL的效应强度约为ZEN及β-ZOL的2～4倍[15]。因此，高效准确的多类型真菌毒素同步检测技术的开发对准确分析谷物的真菌毒素的污染情况，降低由此引发的食品安全风险具有重要意义[3]。

2 谷物中真菌毒素限量标准和检测标准

2.1 限量标准

由于真菌毒素对人与动物健康的潜在威胁，各国和地区对谷物中诸多真菌毒素均建立了严格的限量规定，尤其是一些毒性较强的种类。不同国家和地区制定的限量水平参差不齐，限量标准所规定的食品基质适用范围具有较大差异，缺乏相对的统一性。

2.1.1 黄曲霉毒素

如表1所示，AFB1是目前已发现的毒性最强的黄曲霉毒素，我国针对不同谷物中AFB1的最高允许量进行了严格的分类规定。日本规定食品中的黄曲霉毒素限量为10 μg/kg。美国规定一般食品中黄曲霉毒素含量不得超过15 μg/kg。欧盟对谷物和谷物制品中黄曲霉毒素的限量有更加细致的分类标准，既对谷物和谷物产品中黄曲霉毒素总量(AFB1、AFB2、AFG1、AFG2)进行了规定，又特别标明了其中AFB1的最高限量标准。

表1 国内外主要谷类产品中真菌毒素限量[16-19]

2.1.2 赭曲霉毒素

OTA的限量标准情况与黄曲霉毒素基本相同，世界范围内的限量标准为0.5～50 μg/kg。赭曲霉毒素B(OTB)和赭曲霉毒素C(OTC)毒性较OTA小，在谷物中并不常见，目前尚未制定关于OTB和OTC的限量标准。

2.1.3 单端孢霉烯族毒素和伏马毒素

对于DON大多数国家都有严格的限量规定，但对T-2、HT-2和伏马菌毒素制定限量标准的国家则较少，我国在2008年发布过配合饲料中T-2的允许量(GB 21693—2008)，但现已废止，也未有新的限量标准替代；我国对HT-2和伏马菌毒素的限量也没有明确规定。

2.1.4 玉米赤霉烯酮

我国国标规定小麦和玉米中ZEN的限量为60 μg/kg，欧盟对其限量有严格规定，国际上对于该毒素的限量标准范围在20～350 μg/kg之间。日本、美国和CAC对玉米赤霉烯酮的限量没有明确规定。

续表1

续表1

2.2 检测标准

对比国内外食品真菌毒素检测标准(表2)，欧盟的谷物真菌毒素检测技术标准发展较早，大多采用免疫亲和柱净化或固相萃取等前处理手段，联合高效液相色谱法检测。HPLC具有较高的可靠性，但对于性质相近的物质难以有效分离，需要一定的前处理步骤来保证检测结果的准确性。免疫亲和柱操作简单、分析快速、精密度高，可以获得纯净的样品提取物，同时避免了大量有机试剂的使用，但缺点是价格昂贵大大提高了检测成本。固相萃取效率高，溶剂用量少，但不具备免疫亲和柱的特异性，因而可能因样品净化不彻底影响后续检测。此外，一些标准在样品前处理中使用了衍生化方法以调整待测毒素的色谱性质，从而提高检测准确性，但衍生化步骤繁琐，衍生不完全时会对检测结果造成较大影响。我国在2016年颁布了一系列谷物中真菌毒素检测方法的国家标准。与欧洲标准化委员会(European Committee for Standardization, CEN)和国际标准化组织(International Organization for Standardization，ISO)体系相比，我国真菌毒素的检测标准中所涉及的样品种类更多。在毒素种类上，我国现已制定了T-2毒素检测标准(SN/T 3136—2012)，这在国外真菌毒素检测标准中尚未出现。检测技术上，我国率先规范了使用LC-MS同步检测食品中多种真菌毒素的相关标准(SN/T 3136—2012)，还涉及LC-MS与同位素稀释相结合的检测方法。液质联用对样品前处理的要求相对较低，且相比单纯使用液相色谱检测具有更高的可靠性和检测灵敏度，是目前多种毒素同步检测最为有效的方法，但缺点是设备昂贵，且对操作人员技术要求较高。同位素稀释法只需对复杂混合物体系进行部分分离、纯化就可对物质进行定量和定性检测，但是操作繁琐，对实验结果处理也更耗时。

表2 中国与欧盟现行标准中多种真菌毒素在谷物中的检测方法[19-25]

此外，在我国的行业标准、进出口标准和地方标准中，谷物中多种真菌毒素的同步检测技术也有涉及。在SN/T 3136—2012中，将LC-MS/MS作为花生、谷类及其制品中黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、伏马毒素B1、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、T-2毒素、HT-2毒素的同步检测方法；在DB34/T 2776—2016中，采用LC-MS分两步对谷物中脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素(DON、15A-DON、3A-DON)、黄曲霉素(B1、B2、G1、G2)、伏马毒素(FB1、FB2)和ZEN进行测定，但上述检测标准只有检测限。在LS/T 6133—2018中，利用LC-MS同步检测谷物中的16种真菌毒素，并能对16种真菌毒素进行定量检测。但是以上三个标准无法满足欧盟真菌毒素限量标准中婴幼儿食品不得检出AFT和OTA低于0.5 μg/kg的限量要求。因此，建立高灵敏度、高通量的真菌毒素同步检测方法至今仍是食品安全领域的一项重大挑战，亟需进一步发展和规范化。

3 多种真菌毒素同步检测方法

近年来，多种毒素同步检测技术的发展相对较为迅速。论文综述了真菌毒素同步检测方法，主要包括ELISA、免疫层析、分子技术、生物传感、高效液相色谱法、色谱-质谱联用分析。

3.1 酶联免疫吸附(ELISA)

酶联免疫吸附法是将已知的抗原或抗体固定于固相载体表面，使酶标抗原或抗体与之发生特异性结合[26]。目前根据ELISA技术开发的商业化的真菌毒素检测试剂盒已在市场上广泛推广，Dong等[27]基于酶联免疫吸附，开发了一种能同步检测ZEN及其5种主要类似物的方法。不同基质样品ZEN及其主要类似物检测限和定量限分别为114.2～812.3 ng/L和237.1～1 653.9 ng/L。Arola等[28]采用ELISA对小麦、大麦和燕麦中的T-2和HT-2毒素进行同步检测，相应的检测限分别为0.3、0.1、0.3 ng/mL。ELISA法操作简便、特异性强、灵敏度高，适合大量样品的快速筛选，但其测定结果易出现假阳性问题。同时，ELISA法采用酶蛋白作为标记物，需要进行复杂的前处理消除样品中物质的干扰[29]。

3.2 免疫层析技术

免疫胶体金技术是一种以胶体金作为抗原或抗体的示踪剂标记物的可视化免疫检测技术[26]。基于免疫胶体金技术开发的商业化的真菌毒素检测试剂盒已在市场上得到初步应用，李鑫[30]建立了可同时检测黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮三种真菌毒素的免疫胶体金技术，可视化检测限分别为0.25、0.5、1 ng/mL。Duan等[31]采用胶体金技术，在10 min内可完成玉米中OTA、FB1和ZEN的同步检测，可视化检测限分别为5、20、10 ng/mL。免疫胶体金技术在多种真菌毒素检测上虽然具有操作简便、快速，可实现现场检测等优势，且近年来随着技术的进步检测灵敏度也得到了较大改善，但胶体金作为标记材料存在成本高、易受环境干扰、易受样品基质干扰等问题，同时由于试纸条制备时易出现不均匀现象以及非特异性吸附都会导致检测结果产生较大误差[29]。

3.3 分子技术

3.3.1 多重聚合酶链反应技术(Multiplex PCR)

多重PCR技术，又称多重引物PCR或复合PCR，是在同一PCR反应体系里加上两对以上的引物，同时扩增出多个核酸片段，其反应原理、反应试剂和操作过程与仅使用一对引物的普通PCR相同。Priyanka等[32]基于多重引物PCR技术以及黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A、单端孢霉烯族毒素、玉米赤霉烯酮和延胡索霉素的产毒基因建立了一种快速、经济、简便，能同时检测这5种毒素产生菌的方法，可用于预测谷物中这几种主要真菌毒素的污染情况。Nwachukw等[33]基于聚合酶链反应条件下扩增的黄曲霉、赭曲霉和青霉的产毒基因，筛选市场上销售的棕榈油样品中的黄曲霉毒素基因和赭曲霉毒素基因，对食品加工过程中产生真菌毒素的真菌进行监测。多重PCR虽然有着广泛的应用前景，但是存在一些弊端。它本质上检测的是某一段产毒基因，而毒素产生涉及复杂的代谢过程，往往会受到诸多环境因素的影响，部分非产毒菌株有时也会携带一段产毒基因，因而检测到某一段目标产毒基因并不代表一定存在毒素污染，即使用多重PCR进行毒素污染的预测极有可能得到假阳性结果。此外，多重PCR扩增效率的一致性是最大的难题，扩增子越多，不均一性越高，检测的准确性相对也越难以保证。另一方面，如何降低检测成本也是未来完善多重PCR真菌毒素检测技术需要考虑的问题。

3.3.2 荧光原位杂交(FISH)

荧光原位杂交是以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的非放射性原位杂交方法。许琳[34]利用不同颜色的微球标记单克隆抗体建立了真菌毒素混合污染多色免疫层析同步检测技术，实现黄曲霉毒素B1、T-2和玉米赤霉烯酮混合污染的同步检测，其可视检测限分别为1.6、64.2、6.3 nmol/L。欧阳岁燕[35]以量子点纳米球为荧光标记材料，分别制备3种真菌毒素的抗体荧光探针，建立了能同步检测AFB1、ZEN、FB1的量子点纳米球免疫层析检测技术。在甲醇溶液、玉米基质、花生基质中,该方法对AFB1、ZEN、FB1的检测限分别为2.4、2.5、4.5 ng/kg，20.4、28.1、36.3 ng/kg，2.5、3.2、4.0 ng/kg，检测线性范围均可达两个数量级。但这项研究只是从原理上说明了这项技术能对真菌毒素等小分子量毒素进行多重分析，对于后续实际应用还有一段路要走。

3.4 生物传感

生物传感器是以生物质敏感材料(包括抗体、酶、核酸、微生物、细胞、组织等)为识别元件，结合能将化学信息转化为光、电、声等可测量信号的信号元件组成的检测分析系统[36]，由于具有高通量、高灵敏度和选择性，操作简单，可实现快速检测等优点，已被广泛用于真菌毒素同步检测。Wang等[37]开发了一种能同时检测OTA和FB1的电化学磁控适配体传感器，该法对OTA和FB1的检测范围分别为10pg/mL～10 ng/mL和 50 pg/mL～50 ng/mL，并成功应用于玉米样品。Nolan等[38]利用质量敏感微阵列(MSMA)同步、半定量检测T-2毒素、ZEN和FB1，灵敏度分别为6.1、3.6、2.4 ng/mL。生物化学传感器虽然快速便捷，但是技术仍不成熟，在检测范围、灵敏度、抗干扰能力、重现性、造价和重复使用率等方面还存在不足，需要进一步研究。

3.5 HPLC

高效液相色谱法由于检测结果较为可靠，且成本和对操作人员的技术水平要求与质谱联用相比都相对较低，因而仍是目前甚至未来很长一段时间实验室广泛采用的真菌毒素标准分析方法。Marcin等[39]采用HPLC-UV对波兰市场上100个啤酒样品中的毒素进行了同步测定，DON、NIV和DON-3G(deoxynivalenol-3-glucoside)的发生率分别为56%、83%和67%。Ozgur等[40]采用HPLC-UV和HPLC-FLD对谷物及其制品中的DON和ZEA进行了同步测定，定量限分别为46.90～72.30 μg/kg和3.50～3.70 μg/kg。但HPLC对真菌毒素的定性与定量都需要标准品；在实际实验环境下，真菌毒素的保留时间会随着环境等因素的变化而产生偏移；对于多种毒素的测定，前处理操作复杂，液相条件的摸索与方法建立较为耗时，极性相近的物质很难分离。

3.6 GC/LC-MS

近年来，在有关真菌毒素检测的文献中，色谱-质谱(MS)联用检测方法占50%以上[1]。质谱检测的高选择性在一定程度上简化了样品前处理和纯化步骤，并能提供毒素分子详细的结构信息，提高对目标物识别的准确性与灵敏度。国内最近的一项研究表明，通过HPLC-MS可实现小麦粉中28种真菌毒素的同步检测[41]。目前，在大部分真菌毒素检测研究中，基本采用MS与气相色谱(GC)或液相色谱(LC)联用的方法。GC-MS在测定之前需要对毒素化合物进行衍生化，样品预处理较为复杂。Carrasco等[42]采用GC-MS/MS对182份谷物粉碎样品中的单端孢霉素、棒曲霉素和玉米赤霉烯酮进行测定，所测真菌毒素的定量限低于10 μg/kg，谷物的回收率在毒素浓度为20 μg/kg和80 μg/kg时，分别为76%～108%和77%～114%，RSD小于9%。

LC-MS则不需要进行衍生化就可对多种毒素同时进行定性和定量检测，特异性强、灵敏度高、检出限低，是目前被广泛采用的真菌毒素同步检测方法。LC-MS/MS能一次性的定性和定量检测多种真菌毒素，成为近年来多种真菌毒素同步检测的主要方法。Elaridi等[43]采用LC-MS/MS同时检测小麦谷物、小麦面粉和面包中的OTA、OTB、T-2和HT-2毒素，准确度高达到98%～100%，回收率达到93%～105%。Scarpino等[44]采用高效液相三重四极杆串联质谱(HPLC-ESI-TQ-MS/MS)同时测定玉米和小麦中的真菌毒素，在反应监测(SRM)模式下，对FB1、FB2、DON、ZEA、AFB1、AFB2、AFG1、AFG2等17种真菌毒素进行负离子和正离子扫描，选定强度相对大的子离子，以母离子-子离子对对玉米和小麦中的毒素分子进行确证。三重四极杆串联质谱定量能力好，但是分辨力不足，容易受m/z近似的离子干扰，因而Wang等[37]采用了分辨率更高且对m/z近似离子具有更好的定性区分度的超高效液相色谱-串联四极杆飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF-MS)对玉米中的9种真菌毒素进行了同步检测，检测限为0.05～50 μg/kg，定量限为0.1～200 μg/kg。此外，谢刚等[45]基于四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱技术，建立了同时检测玉米中16种真菌毒素和11种农药残留的方法。该法直接使用目标物母离子的精确分子质量进行定量分析，不需要对目标物子离子进行逐个优化，大大简化了分析方法建立的难度。静电场轨道阱质谱对目标物跟未知物质有更高的确证能力，能有效预防假阴性、能分辨出质量数差别极小的离子，并且能同时筛查大量分析物[46]。与TOF相比，静电场轨道阱质谱在大大提高分辨率的同时，也具备出色的定量能力。液质联用在检测灵敏度和准确度上有着极大的优势，但检测成本较高，开发低成本、快速、操作简便的检测技术，并应用于现场同步检测真菌毒素是未来液质联用法的研究热点[47]。

4 总结与展望

由于谷物真菌毒素污染的频发性及其对人与动物健康造成的威胁，国内外已针对这一问题制定了一系列安全限量与检测标准，但仍存在两个突出的问题：一是目前世界各国现有标准体系对毒素及谷物种类划分不够细致，且缺乏统一性；二是受到毒理学研究与检测技术发展限制，仍有许多已被证实具有安全隐患的真菌毒素尚未被纳入标准体系，且目前的安全限量与检测标准基本未考虑多种真菌毒素共存这一极为普遍的情况。谷物真菌毒素污染的监管离不开有效的检测手段，对于多种毒素同步检测，尽管技术上已经有了较大的突破，但现有方法在检测准确性、成本和可操作性方面仍有待完善，开发高通量、快速、稳定、低成本的多种毒素同步检测技术依然是食品安全领域面临的一项挑战。另一方面，进一步推进真菌毒素毒理学研究，尤其是建立多种毒素共存时协同毒性效应的有效评估策略，对于更为合理的安全限量标准的制定也具有重大意义。