酸笋中高产乳酸乳酸菌的筛选、鉴定及发酵条件优化

吴锦兰，付玉麟，周小玲，陈正培，熊建文*，崔 娜，巩 僖

（柳州工学院 食品与化学工程系，广西 柳州 545616）

酸笋作为我国传统发酵食材，在南方地区一直被广泛食用，具有悠久的历史[1]。酸笋不仅富含膳食纤维和矿物质元素等营养保健物质，而且具有独特的风味特征，朱照华[2]研究发现，酸笋中的挥发性风味物质高达53种，包含了酚类、醇类、醛类和酸类等风味成分，酸笋也因独特的酸味受到人们的钟爱。长期以来，酸笋的生产多为自然发酵，以竹笋为原料，利用自然附着微生物发酵制作而成，酸笋中蕴含着丰富的微生物资源[3]。相关研究表明[4-6]，传统发酵食品中存在多种乳酸菌，这些乳酸菌不仅能改变发酵食品的风味、提高营养价值，而且还能进一步提高发酵食品的生理保健机能。

乳酸菌是一类能发酵糖类产生乳酸的革兰氏阳性、不产芽孢的细菌总称[7-10]。乳酸菌在发酵过程中能够分泌产生乳酸等有机酸，不仅赋予食品柔和的酸味，刺激人的食欲、帮助消化，而且能够有效降低发酵系统的pH值，形成适于乳酸菌生长的环境，缩短发酵周期，同时抑制不耐酸性腐败菌的生长，延长食品保质期[11-13]。乳酸作为天然的有机酸，也被广泛应用于食品、纺织业、化学和制造业中[14]。近年来，随着对乳酸菌益生作用研究的不断深入及乳酸需求量的逐步增加，传统发酵食品中高产乳酸乳酸菌的筛选也已逐渐成为研究热点。葛菁萍等[15]从酸菜发酵液中分离筛选得到一株高产乳酸的乳酸菌，经鉴定为干酪乳杆菌（Lactobacillus casei），该菌株被应用于有机酸发酵及酸菜发酵的酸化处理。

目前，有关酸笋的研究主要集中在营养成分、风味物质和制作工艺上[16-19]，而有关酸笋中功能性乳酸菌的研究鲜见报道。本研究以柳州传统发酵酸笋为原料，采用MRS平板培养法对酸笋自然发酵液中的乳酸菌进行分离，结合溶钙圈试验和高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法对高产乳酸乳酸菌进行筛选，随后对该优良菌株进行分子生物学鉴定和发酵条件优化，以期为酸笋来源乳酸菌发酵产生乳酸的研究奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 原料

酸笋自然发酵液：采集于广西柳州的五个地区（柳南、柳北、柳城、城中、鹿寨）。

1.1.2 化学试剂

蛋白胨、牛肉浸膏、胰蛋白胨、细菌学蛋白胨、多聚蛋白胨、酵母粉（均为生化试剂）：广东环凯微生物科技有限公司；琼脂粉（生化试剂）：北京奥博星生物技术有限公司；葡萄糖、蔗糖、乳糖（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；碳酸钙、乙酸钠、柠檬酸三铵（均为分析纯）：广东光华科技股份有限公司。

1.1.3 培养基

MRS液体培养基[21]：蛋白胨10.0 g/L，牛肉浸膏5.0 g/L，酵母粉4.0g/L，葡萄糖20.0g/L，吐温-801.0mL，K2HPO42.0g/L，结晶乙酸钠5.0 g/L，柠檬酸三铵2.0 g/L，MgSO2·7H2O 0.2 g/L，MnSO2·4H2O 0.05 g/L，pH值6.2。121 ℃高压蒸汽灭菌30 min。

MRS固体培养基[20]：向上述MRS液体培养基中加入琼脂粉15 g/L，碳酸钙1.0 g/L，pH值6.2。121 ℃高压蒸汽灭菌30 min。

1.2 仪器与设备

LRH-150生化培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；SW-CJ-2F超净工作台：苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；UV-1800型紫外可见分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；L9800基因扩增仪：北京莱普特科学仪器有限公司；GenoSens1880凝胶成像分析系统：上海勤翔科学仪器有限公司；Nikon Eclipse E200光学显微镜：上海衡浩仪器有限公司；LC-20A高效液相色谱仪：日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分离与纯化

取柳州酸笋发酵液样品，以无菌生理盐水进行梯度稀释（10-1～10-5）后涂布于MRS固体培养基，于37 ℃恒温静置培养24 h，挑取溶钙圈明显，表面光滑、中间隆起，白色或者乳白色的菌落，在MRS固体培养基上划线分离，多次纯化，经过革兰氏染色和接触酶反应后，挑选出革兰氏阳性、接触酶阴性菌株接种斜面、编号、保存备用。

1.3.2 高产乳酸乳酸菌的筛选

把分离得到的乳酸菌菌株接种到10 mL MRS液体培养基中，37 ℃、170 r/min条件下培养24 h，取10 μL发酵液置于含MRS固体培养基的牛津杯中，每个菌株设置3次重复，以空白MRS液体培养基为对照，37 ℃条件下静置培养24 h，测量溶钙圈直径，筛选出几株溶钙圈较大的乳酸菌，保存备用。

将钙溶圈较大的乳酸菌接种到10 mLMRS液体培养基中，37℃、170r/min条件下培养48h，取1mL发酵液，10000r/min离心2 min后取上清液，用0.22 μL滤膜过滤后进样，利用HPLC法测定乳酸产量。

1.3.3 高产乳酸乳酸菌株的鉴定

形态观察：按照《伯杰氏细菌鉴定手册》[21]的方法，观察待测菌株的菌落和菌体形态特征。

分子生物学鉴定：将待测菌株接种于10 mL MRS液体培养基中，37 ℃、170 r/min条件下振荡培养过夜后，采用脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取试剂盒提取基因组，用1%琼脂糖凝胶电泳检测提取基因组的质量。将完整且纯度高的基因组DNA适当稀释作为DNA模板，采用16SrDNA通用引物1492R（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）和16S 27F（5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'）进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增，将PCR扩增产物送至华大基因生物公司进行测序。测序结果提交至美国国家生物技术信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank数据库中，利用基本局部比对搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）进行同源性比对搜索，获得最相近菌株的16S rDNA基因序列，用Clustalx1.8按照最大同源性的原则进行排序，采用MEGA6.0软件中的邻接（neighbor-joining，NJ）法构建系统发育树，自举法（bootstrap）对系统发育树进行检验，重复1 000次。

1.3.4 高产乳酸乳酸菌发酵条件优化

用接种环挑取少许高产乳酸乳酸菌于10 mL MRS液体培养基中，37 ℃、170 r/min条件下振荡培养12 h进行菌种活化后，取100 μL菌液于10 mL MRS液体培养基中，37 ℃、170 r/min条件下振荡培养24 h后得到种子液。

接种量的确定：将高产乳酸乳酸菌的种子液分别按照0.2%、1.0%、1.8%、2.6%、3.4%（V/V）的接种量接种于MRS液体培养基中，37 ℃、170 r/min条件下振荡培养24 h后取发酵液进行乳酸含量测定，考察不同接种量对菌株产乳酸能力的影响。

在此基础上，依次考察pH值（4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5）、培养温度（22 ℃、27 ℃、32 ℃、37 ℃、42 ℃、47 ℃）、培养时间（6 h、12 h、18 h、24 h、30 h、36 h）、碳源种类（葡萄糖、蔗糖、乳糖）及氮源种类（蛋白胨、胰蛋白胨、细菌学蛋白胨、多聚蛋白胨）对菌株产乳酸能力的影响。

1.3.5 乳酸含量的测定

采用HPLC法测定乳酸含量[22]。HPLC条件：C18色谱柱，流动相为2.5 mmol/L NH4H2PO4（含1%甲醇）溶液（pH 2.5），流速为1 mL/min，检测波长为210 nm，进样体积为20 μL，分析时间24 min。

1.3.6 数据处理与统计

使用Excel 2013进行标准偏差分析，用T-test进行差异性分析，用Origin9.0软件进行绘图分析。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌的分离

从酸笋发酵液中共分离得到144株乳酸菌，菌株的来源及编号见表1。

表1 酸笋发酵液中乳酸菌的分离结果Table 1 Isolation results of lactic acid bacteria from sour bamboo shoot fermentation liquid

2.2 高产乳酸乳酸菌的筛选

通过溶钙圈法从144株乳酸菌中筛选得到10株钙溶圈较明显的乳酸菌，测定这10株乳酸菌的钙溶圈直径及乳酸产量，结果见表2。其中乳酸菌LB-1-23发酵液高效液相色谱图见图1。由表2可知，10株乳酸菌的钙溶圈直径均＞9 mm，其中乳酸菌LB-1-23的钙溶圈直径最大，为11.00 mm。10株乳酸菌的乳酸产量均＞10 g/L，其中乳酸菌LB-1-23的乳酸产量最高，达12.181 g/L，故选取菌株LB-1-23为高产乳酸乳酸菌，进行后续研究。

表2 乳酸菌的溶钙圈直径和乳酸产量Table 2 Calcium dissolving circle diameter and lactic acid production of lactic acid bacteria

图1 菌株LB-1-23发酵液的高效液相色谱图Fig.1 High performance liquid chromatography of fermentation liquid of strain LB-1-23

2.3 高产乳酸乳酸菌菌株的鉴定

菌株LB-1-23在MRS固体培养基上培养24 h后，菌落及细胞形态见图2。由图2可知，菌落呈圆形、乳白色、表面光滑、中央微凸起，细胞呈短杆状、单个或成对存在，无芽孢，革兰氏染色为紫色呈阳性。

图2 菌株LB-1-23的菌落（a）及细胞（b）形态Fig.2 Colony (a) and cell (b) morphologies of strain LB-1-23

以菌株LB-1-23的基因组DNA为模板对其16S rDNA基因序列进行PCR扩增，PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图3。

图3 菌株LB-1-23的16S rDNA PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图Fig.3 Agarose gel electrophoresis of 16S rDNA PCR amplification of strain LB-1-23

由图3可知，PCR扩增产物碱基长度为1 500 bp，与预期结果相符，委托北京六合华大基因科技有限公司进行测序。将测序结果提交至NCBI的GenBank数据库中进行BLAST比对搜索，选取同源性较高的模式菌株的16S rDNA基因序列，采用MEGA6.0软件的NJ法构建系统发育树，结果见图4。由图4可知，菌株LB-1-23与植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）聚于一支，亲源关系最近，同源性为99%。结合形态学特征与分子生物学鉴定结果，鉴定菌株LB-1-23为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。

图4 基于16S rDNA基因序列菌株LB-1-23的系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of strain LB-1-23 based on 16S rDNA gene sequences

2.4 乳酸菌LB-1-23产乳酸发酵条件优化

2.4.1 不同接种量对乳酸菌LB-1-23发酵产乳酸的影响

不同接种量对菌株LB-1-23发酵产乳酸的影响见图5。由图5可知，当接种量在0.2%～2.6%之间时，乳酸菌LB-1-23的乳酸产量随着接种量的增大逐渐增大；当接种量为2.6%时，乳酸菌LB-1-23的产乳酸能力最佳，乳酸含量为11.19g/L；当接种量＞2.6%时，乳酸产量随着接种量的增大逐渐减小。故乳酸菌LB-1-23发酵产乳酸的最佳接种量为2.6%。

图5 不同接种量对乳酸菌LB-1-23发酵产乳酸的影响Fig.5 Effect of different inoculum on lactic acid production by lactic acid bacteria LB-1-23 fermentation

2.4.2 不同pH值对乳酸菌LB-1-23发酵产乳酸的影响

不同pH值对乳酸菌LB-1-23发酵产乳酸的影响见图6。由图6可知，随着pH值的升高，乳酸菌LB-1-2的乳酸产量呈先升高后降低的趋势，当pH值为5.5时，乳酸菌LB-1-23的产乳酸能力最高，乳酸产量为12.08 g/L。故确定乳酸菌LB-1-23发酵产乳酸的最适pH值为5.5。

图6 不同pH值对乳酸菌LB-1-23发酵产乳酸的影响Fig.6 Effect of different pH on lactic acid production by lactic acid bacteria LB-1-23 fermentation

2.4.3 不同发酵温度对乳酸菌LB-1-23发酵产乳酸的影响

不同发酵温度对乳酸菌LB-1-23发酵产乳酸的影响见图7。由图7可知，随着发酵温度的升高，乳酸菌LB-1-23的乳酸产量呈先升高后降低的趋势，当发酵温度为32 ℃时，乳酸产量最高，为12.35 g/L。故确定乳酸菌LB-1-23发酵产乳酸的最适发酵温度为32 ℃。

图7 不同发酵温度对乳酸菌LB-1-23发酵产乳酸的影响Fig.7 Effect of different fermentation temperature on lactic acid production by lactic acid bacteria LB-1-23 fermentation

2.4.4 不同发酵时间对乳酸菌LB-1-23发酵产乳酸的影响

不同发酵时间对乳酸菌LB-1-23发酵产乳酸的影响见图8。

图8 不同发酵时间对乳酸菌LB-1-23发酵产乳酸的影响Fig.8 Effect of different fermentation time on lactic acid production by lactic acid bacteria LB-1-23 fermentation

由图8可知，随着发酵发酵时间的延长，乳酸菌LB-1-23的乳酸产量呈先升高后降低的趋势，当发酵时间为30 h时，乳酸产量最高，为12.53 g/L。故确定乳酸菌LB-1-23发酵产乳酸的最适发酵时间为30 h。

2.4.5 不同碳源对乳酸菌LB-1-23发酵产乳酸的影响

不同碳源对乳酸菌LB-1-23发酵产乳酸的影响见图9。由图9可知，当以葡萄糖为碳源时，乳酸产量最高为12.53g/L。改变碳源为蔗糖和乳糖时，乳酸菌LB-1-23的乳酸产量减小。故确定乳酸菌LB-1-23发酵产乳酸的最适碳源为葡萄糖。

图9 不同碳源对乳酸菌LB-1-23发酵产乳酸的影响Fig.9 Effect of different carbon sources on lactic acid production by lactic acid bacteria LB-1-23 fermentation

2.4.6 不同氮源对乳酸菌LB-1-23发酵产乳酸的影响

不同氮源对乳酸菌LB-1-23发酵产乳酸的影响见图10。由图10可知，当以细菌学蛋白胨为氮源时，乳酸产量最高为12.74 g/L。改变氮源为蛋白胨、胰蛋白胨、多聚蛋白胨时，乳酸菌LB-1-23的乳酸产量减小。故确定乳酸菌LB-1-23发酵产乳酸的最适氮源为细菌学蛋白胨。

图10 不同氮源对乳酸菌LB-1-23发酵产乳酸的影响Fig.10 Effect of different nitrogen sources on lactic acid production by lactic acid bacteria LB-1-23 fermentation

3 结论

本研究从柳州酸笋发酵液中筛选得到一株高产乳酸的乳酸菌LB-1-23，经形态观察及分子生物学鉴定，该菌株被鉴定为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），其产乳酸的最适发酵条件为接种量2.6%，pH值5.5，发酵温度32 ℃，发酵时间30 h，葡萄糖为碳源，细菌学蛋白胨为氮源。在此优化条件下，乳酸产量达12.74 g/L。本研究筛选得到的植物乳酸菌LB-1-23，源于广西发酵酸笋，且具有高产乳酸功能，有望作为直投式优良菌株应用于酸笋发酵中，对在工业上提升酸笋发酵工艺具有重要的指导意义。同时，拓展了发酵产乳酸的微生物菌株来源，为乳酸工业生产实践提供一定的理论参考。