老白干白酒中糖和糖醇类物质研究

王晓丹，向玉萍，印 丽，张福艳，韩 超，姜东明，张煜行*

（1.河北衡水老白干酒业股份有限公司 河北省白酒酿造工程技术研究中心，河北 衡水 053000；2.贵州大学 酿酒与食品工程学院 贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵州 贵阳 550025）

中国白酒是一种在中国有几千年历史的酒精发酵饮料，是世界上最古老的蒸馏酒之一[1]，其有别于其他蒸馏酒的固态发酵工艺使得酒体中含有许多复杂的挥发性和难挥发性组分，赋予了白酒丰富而又独具特色的风味特征[2-3]，是广大科研学者倾尽心血的研究对象。衡水老白干酒以酒色清澈透明，酒体醇香清雅，甘洌挺拔，丰满柔顺，回味悠长的风格特点而被广大消费者所青睐[4]，是中国白酒老白干香型的典型代表[5]。绝大多数白酒均呈甜味，甜味是一种让人感觉比较愉悦的口感，尤其在酒精度高的白酒中，微甜味可以使酒体更加绵柔醇厚[6]。醇类是白酒中醇甜物质的来源，是香与味过渡桥梁，含量恰到好处，甜意绵绵，在酒中起调和作用[7]。

目前，国内外检测糖和糖醇的方法主要有高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法[8]、毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）法[9]、气相色谱-质谱（gas chromatography mass spectrometry，GC-MS）法[10]以及高效阴离子色谱-脉冲安培（high performance anion chromatography-pulsed amperometric detection，HAPEC-PAD）法[11]等。对于白酒中含量较低的待测组分，HPLC常用的检测器由于灵敏度低而达不到检测要求，而气相色谱（gas chromatography，GC）具有分析速度快、操作简单、重现性好、分离能力强、灵敏度高[12-13]等优点，可用于对酒体中的微量组分进行检测，但是其分离柱的使用条件一般低于300 ℃，而酒体中糖和糖醇类物质的沸点较高，并且直接对白酒进行分析检测比较困难，所以需选择有效的预处理方法提取富集以及改变待测组分的状态后才能进行准确的鉴定和分析[14]。衍生化法能将一些高沸点、难挥发的或者热稳定性差的物质转换为沸点低、易挥发的或稳定性良好的待测组分，并且降低有机物的极性，改善色谱峰形，易于气相色谱分析。衍生化法按照反应类型分为：硅烷化反应、酯化反应、醚化反应和酰化反应。其中硅烷化是使用较为广泛的方法，再结合糖和糖醇存在空间位阻效应的特点，使用N,O-双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（N,O-bis（trimethylsilyl）trifluoroacetamide with trimethylchlorosilane，BSTFA）作衍生化试剂效果最好[15]。周斌等[16]建立了BSTFA衍生化与GC-MS技术检测了烟草中几种重要游离糖类，且具有较高的准确度。石亚林等[17]使用N,O-双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA）作为衍生化试剂，结合气相色谱-质谱（GC-MS）及气相色谱-氢火焰离子检测器（gas chromatography-flame ionization detection，GC-FID）检测技术，准确的解析了大曲发酵过程中糖和糖醇的变化规律。

目前，关于使白酒呈现甜味特征的具体成分以及浓度的研究鲜有报道。本研究以老白干香型酒为研究对象，采用衍生化结合GC-MS检测方法对衡水老白干酒中的糖和糖醇进行定性、定量分析，并结合感官品评，分析对酒体甜味特征起重要贡献的成分，以期为后续衡水老白干酒体甜味特征的描述以及产品质量控制提供数据支持和科学的指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

感官品评甜味突出的酒样：甜1-7（取样时间：2017年11月15）；甜3-10（取样时间：2017年11月1）；甜18-7（取样时间：2017年11月15）；甜8-1（取样时间：2017年11月14）；甜1-3（取样时间：2017年11月14）；甜2-6（取样时间：2017年11月13）；甜6小（取样时间：2017年11月14）；甜8-2（取样时间：2017年11月14）；上述酒样均取自衡水老白干酒厂。

葡萄糖、海藻糖、阿拉伯糖、甘油、阿拉伯糖醇、山梨糖醇、肌醇、半乳糖、蔗糖（均为色谱纯）：北京百灵威科技有限公司；赤藓糖醇（色谱纯）：阿拉丁试剂（上海）有限公司；果糖、木糖、甘露糖醇、木糖醇、核糖醇（均为色谱纯）：国药集团化学试剂北京有限公司；C7～C40正构烷烃混标：上海安谱实验科技股份有限公司；吡啶、N,O-双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA）（均为色谱纯）：美国Sigma公司；甲醇（色谱纯）：北京百灵威科技有限公司。

1.2 仪器与设备

SHZ-DⅢ循环多用真空泵、PRA-202E旋转蒸发器：上海普渡生化科技有限公司；TGL-16M台式高速冷冻离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；NV-15G氮吹仪：天津博纳艾杰尔科技；HH-1数显恒温水浴锅：金坛市天竟实验仪器厂；Agilent 7693自动进样器、Agilent 7890B GC-5977A MSD气相色谱-质谱联用仪：安捷伦科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品预处理

取酒样20mL，用旋转蒸发仪在真空条件下蒸干，用1 mL甲醇溶解，取100 μL于2 mL液相小瓶中，室温下温和氮气吹干，待衍生化。

1.3.2 配制标准溶液

分别用甲醇配制质量浓度为100～200 μg/mL的单种标准物质，同时配制质量浓度为100～500 μg/mL的混合标准溶液，并依次进行梯度稀释（500μg/mL、400μg/mL、300μg/mL、200 μg/mL、150 μg/mL、100 μg/mL、50 μg/mL、25 μg/mL、5 μg/mL），吸取100 μL糖混合标准液、加入100 μL一定浓度的水杨苷，混合均匀后用氮气吹干，待衍生化。

1.3.3 BSTFA衍生化

氮气吹干后的样品，依次加入100 μL BSTFA（含1%三甲基氯硅烷）和50 μL吡啶，摇匀，70 ℃反应3 h，反应完成储存于-20 ℃，24 h内完成检测。

1.3.4 GC-MS条件

GC条件：色谱柱HP-5 MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；进样口温度为250 ℃；载气为氦气（He），流速1.0 mL/min，分流比为20∶1；升温程序为40 ℃保持2 min，以6 ℃/min升温至250℃，并保持15 min。MS条件：电子电离（electron ionization，EI）源，电子能量70 eV，扫描范围为50～650 amu，离子源温度230 ℃。

定性方法：已有标准品的物质，通过与标准品的质谱图比对进行鉴定；没有标准品的物质，通过与美国国家标准与技术研究院（national institute of standards and technology，NIST）08标准品库中物质的质谱图比对进行临时性鉴定。

定量方法：内标法。以糖和糖醇与内标物的峰面积比为横坐标，质量浓度比为纵坐标，建立标准曲线。

1.3.5 感官评价

品评小组包括1名具有近20年白酒品评经验的国家白酒评委，和两名具有3年以上白酒品评经验的省级白酒评委。感官品评前先经培训练习，参照GB/T 33405—2016《白酒感官品评术语》[27]中的白酒风味轮所示术语，品评人员对酒样（甜18-7、甜6小、甜8-2）的香气，如花香、甜香、水果香、发酵香（酒香）、青草香等香气的感官强度以及酒样的酸味、甜味、苦味、涩味等口感滋味强度进行评定，评价结果采用五点标度法进行记录，数值范围为0～5，0表示“无该特征”，1、2表示“弱、微”，3表示“中等”，4、5表示“强、明显、突出”，取20 mL酒样于白酒品评专用杯中，在（20±1）℃的温度条件下进行感官评定，取所得分值结果的平均值作风味雷达图。

2 结果与分析

2.1 酒样中糖和糖醇类物质的定性

图1 糖和糖醇类物质标准品经三氟乙酰胺衍生化后的总离子流色谱图Fig.1 Total ion chromatogram of sugar and sugar alcohols standard derivatized by bistrifluoroacetamide

通过BSTFA衍生化结合GC-MS分析，检测到酒样中含有11种醇甜类物质，其中包括4种糖类（阿拉伯糖、木糖、果糖和葡萄糖）、7种多元醇类（甘油、赤藓糖醇、木糖醇、阿拉伯糖醇、核糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇）。上述11种糖和糖醇标品的混合溶液经BSTFA衍生化后的总离子色谱图如图1所示。其中单糖（阿拉伯糖、木糖、果糖、葡萄糖）会出现两个峰，这是由于衍生化过程使得单糖的构型发生变化，因此定量时需要将对应的峰面积进行加和。

2.2 酒样中糖和糖醇类物质的定量

根据上述确定的定量方法，在定性的基础上对8种酒样进行定量分析，将不同系列浓度的标准溶液处理好，加入内标进行标准曲线的绘制，可得到9种标准品的线性回归方程、线性范围、相关系数、回收率、检出限及相对标准偏差，结果见表1。

由表1可知，回收率在92%～100%之间，相关系数R2在0.986 0～0.999 4之间，以信噪比为3计算这11种物质的检测限，检测限在0.143～1.465mg/L，相对标准偏差在3.6%～9.7%，表明该检测方法具有一定的准确性和精确性。

表1 9种标准品的回归方程、线性范围及检出限Table 1 Regression equation,correlation coefficient and detection limit of 9 standards

由表2可知，在检测到的糖和糖醇化合物中，葡萄糖的含量最高（3.33 mg/L），其次是甘油（1.20 mg/L），均大于1 mg/L。葡萄糖、甘油均呈甜味。其中甘油含量最大的是酒样2-6，葡萄糖和果糖含量最高的酒样是3-10。糖醇类物质的含量主要在0.1～1.5 μg/L，其中含量最高的是木糖（0.94 μg/L），其次是阿拉伯醇（0.6 μg/L）和木糖醇（0.28 μg/L），含量最少的为核糖醇（0.1 μg/L）。虽然阿拉伯糖醇、核糖醇和木糖醇互为同分异构体，但在白酒中的含量不同，在这批酒样中含量由高至低依次为阿拉伯糖醇、木糖醇、核糖醇。甘露糖醇和山梨糖醇互为同分异构体，在这批酒样中有的酒样中没有是因为含量太低，并未有精确定量的结果。其中酒样3-10中含甘露糖醇和山梨糖醇的量最多分别为0.26 μg/L和0.20 μg/L。赤藓糖醇和阿拉伯糖虽然能在仪器中检查得到但是含量太低，也并未有精确定量的结果。

2.3 老白干香型与酱香型白酒的比较

将本实验结果与酱香型白酒中糖和糖醇类物质进行对比，发现两种香型白酒中所含物质种类大致相同，但在含量上存在着差异，为探讨两者存在差异的可能原因，将从功能酵母菌种类及生产工艺进行分析，区别详见表3。

表3 老白干香型与酱香型白酒的比较Table 3 Comparison of Laobaigan-flavor and sauce-flavor Baijiu

由表3可知，从两种香型白酒生产过程中分离纯化出的产糖或糖醇的功能酵母，在种类和来源上都存在着很大的不同。衡水老白干采用的是中温大曲，比酱香型白酒的高温大曲的发酵温度低10 ℃左右，酱香型白酒的大曲中温度高且含糖量高，从而能在大曲中分离出更多种类的产多元醇的酵母。白酒酿造属于固态厌氧发酵，酒醅充当着微生物生长培养基的角色。衡水老白干酒有续茬混蒸混烧老五甑工艺与清蒸清烧三排净工艺，其中地缸发酵则是衡水老白干酒必不可少的典型工艺[20-22]。地缸发酵便于热量散发，保持最佳发酵温度，地缸周围土壤与地缸外表面的接触面是一个热量交换面，酒醅与地缸之间热量通过地缸壁进行传递，达到一种热平衡[23]，从而促进酒精的生成；并且密封性好，有利于酵母在无氧条件下的发酵作用[24]。而酱香型白酒酿造处于高温、多雨、潮湿的气候环境中，从而形成了酱酒“三高”工艺特点[20]，其中“高温堆积”又称“二次制曲”，是酱香型白酒生产过程中的核心工艺之一，在相对开放式的空间环境条件下，为酒醅富集培养了大量的微生物，使后期入窖发酵顺利进行，酵母菌主要就是通过高温堆积阶段进入整个发酵环节的[22]；并且，该过程也为酱香型白酒选择出适合生产的优势微生物[25]。综上，由于两种香型的白酒在核心工艺和生产环境的不同，引起发酵过程中功能微生物种类的区别，最终使得带入酒体中的糖和糖醇类物质存在着差异。

2.4 甜味突出酒样滋味分析

在白酒中，呈香呈味的微量成分仅占1%～2%，实验中所检出的糖和糖醇类物质本身均呈甜味，它们在酒体呈甜滋味中能起到一定作用，是白酒中甜味的主要来源，另外有文献指出，白酒中除了多元醇呈现甜味以外，也有检测到其他有些成分呈现甜味，如乳酸乙酯、棕榈酸乙酯等在一定浓度时都带有微甜味[26]，然而白酒中的甜味是本身物质的存在，同时也是各味协调的结果。白酒中的各种成分相互配合，协调比例后会使酒体产生“甜”的滋味特征，使得酒体的气、味达到和谐，给人带来愉悦舒适的口感体验。

后期挑选了3个实验所用的甜味突出酒样，参照GB/T 33405—2016《白酒感官品评术语》中白酒风味轮的感官术语[27]，对各个风味特征进行感官品评，结果采用五点标度法，整理结果做出3个酒样的风味雷达图见图2。

图2 甜味突出酒样风味轮廓分析Fig.2 Flavor profile analysis of particularly sweet Baijiu samples

整体上来说，这3个酒样的风味轮廓图略有差异，但各风味特征强度走向大致相同，甜味和甜香都非常突出，涩味、苦味等影响酒体口感的不良味道强度较弱，并兼具较强烈的果香、花香以及特有的枣香味，糖和糖醇类物质的含量在整个酒体中只占0.03%左右，但在感官品评上却呈现了非常突出的甜味以及甜香的特征。

3 结论

在本次研究中，使用BSTFA衍生化结合GC-MS技术对酒样中的糖和糖醇类化合物进行检测，共测到11种物质，包括4种糖和7种糖醇类物质。并精确定量了其中的3种糖和6种糖醇类物质，其中，糖类的葡萄糖（3.33 mg/L）和糖醇类的甘油（1.20 mg/L）含量较高。总的糖和糖醇类物质在白酒微量成分中所占比例低至0.03%左右，虽然含量非常少，但这些物质本身呈现甜味，对酒体的呈甜滋味有一定贡献，给人以“绵甜”、“柔和”的味觉感受，糖和糖醇类物质与其他微量成分之间相互协调、配合，构成了衡水老白干酒“醇香清雅，酒体协调、醇厚甘冽、回味悠长”的风格特点。现已对衡水老白干酒体中呈甜成分进行了准确的定量分析，为酒体设计以及质量控制提供了理论依据。今后可致力于生产工艺或菌种选育等方面的研究，来提高白酒中糖或糖醇的含量，在保证酒体中醇、酸、酯等成分的整体协调的基础上，以期达到增加酒体醇厚感，提高白酒品质的目的。