益生菌对发酵菠萝果汁综合品质的影响

李 璐，徐玉娟，温 靖*，陶家琪，彭 健，吴继军，余元善

（广东省农业科学院 蚕业与农产品加工研究所 广东省农产品加工重点实验室，广东 广州 510610）

益生菌是一类对宿主健康有益的微生物[1]，主要由乳杆菌属、双歧杆菌属和部分革兰氏阳性球菌组成[2]，具有提高人体免疫力、降低胆固醇、改善肠道健康和抑制肿瘤等功能，常被添加至食品中，尤其是乳制品[3]。很多消费者因乳糖不耐症、牛奶蛋白过敏、半乳糖血症或高胆固醇血症的影响，无法食用乳制品[4]。因此为益生菌寻找能够替代乳制品的发酵基质显得尤为重要。果蔬汁富含糖类、蛋白质和矿物质等营养成分，适合微生物的生长，被认为是开发非乳制品益生菌产品的理想基质[5]。此外，果蔬汁中含有抗坏血酸等具有去除氧气能力的物质，使果汁呈微氧环境，可促进益生菌的生长[6]。

菠萝（Ananas comosus）属凤梨科，是热带、亚热带特产水果之一，在我国水果市场中占有重要地位[7]。菠萝营养成分丰富，富含糖类、蛋白质、微量元素、维生素和有机酸等物质[8]，具有清热解暑、生津止渴、促进消化的功能[9]。菠萝作为一种季节性很强的水果，常温条件下较难保存。因此，菠萝除鲜食之外，常被加工成果汁、罐头、果酱、果冻和菠萝脆片等产品，以延长其货架期[10]。果蔬汁经益生菌发酵不仅可赋予其调节肠道健康、增强机体免疫力、抗氧化等功能[11-12]，还可以改善其风味[13]，已引起研究人员的广泛关注。胡贝多等[14]发现，红枣汁经益生菌发酵后，不仅能够显著提高其抗氧化能力，而且有助于丰富其风味。陈华丽等[15]发现，雪莲果汁经鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）发酵能够减轻果汁的褐变，获得风味更佳的发酵雪莲果汁产品。HASHEMI S M B等[5]发现，柠檬汁经植物乳杆菌LS5发酵后，其抗坏血酸和抗菌能力较未发酵柠檬汁均有提高。菠萝香气浓郁、出汁率高，可作为益生菌发酵的基质[6]。然而，目前关于益生菌发酵菠萝果汁的研究较少，阻碍益生菌发酵菠萝果汁产品的开发。

随着国民经济的飞速增长，人们对食品健康的关注度不断提高，以水果汁和蔬菜汁等非乳品原料的发酵产品受到广泛关注，研究不同发酵菌株对果汁综合品质的影响，对适宜菌株的挖掘及新产品的开发具有重要意义。因此，本研究以菠萝果汁为原料，研究4种常见益生菌（干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、肠膜明串珠菌）对其发酵过程中营养品质和感官品质的影响规律，挖掘适用于菠萝果汁发酵的菌株，以期为菠萝果汁益生发酵产品的开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

菠萝：市售；干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）、肠膜明串珠菌（Lactobacillus mesenteroides）：保存于广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所果蔬加工创新实验室；碳酸钠（食品级）、MRS肉汤及其固体培养基：广东环凯微生物科技有限公司；果胶酶（30 000 U/g）、纤维素酶（10 000 U/g）：烟台市帝伯仕自酿机有限公司；芦丁、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、乳酸、柠檬酸：上海源叶生物科技有限公司；维生素C（vitamin C，VC）、D-抗坏血酸、没食子酸：天津市大茂化学试剂厂；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

PB-J-S02E破壁料理机：江门市贝尔斯顿电器有限公司；PB-10型pH计：德国Sartorius公司；HWS24型电热恒温水浴锅：上海一恒科技有限公司；D3024R台式高速冷冻离心机：美国赛洛捷克SCILOGEX公司；UV1800型紫外可见分光光度计：日本岛津公司；SPX-250B-Z型生化培养箱、YXQ-LS-5OS型立式蒸汽灭菌锅：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；SW-CJ-1F型无菌操作台：苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；SPME手动进样器、萃取纤维头50/30 μm DVB/CAR/PDMS：美国Supelco公司；6890N-5975B气相色谱-质谱联用仪：美国Agilent公司；SPD-M20A高效液相色谱仪：日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 菠萝果汁的制备

新鲜菠萝去皮去眼、切块榨汁，加入菠萝原浆质量0.05%的果胶酶和纤维素酶，在50 ℃水浴条件下酶解1 h，过滤，滤液装入复合铝箔袋中，贮藏于-20 ℃冷库中备用。

1.3.2 乳酸菌种子液的制备

将保存于-80 ℃的4种乳酸菌保藏培养物分别加入MRS肉汤培养基中，37 ℃静置过夜培养进行活化复壮，活化复壮后以1%的接种量接入另一MRS肉汤培养基中，37 ℃静置培养18 h作为种子液。

1.3.3 菠萝果汁的发酵培养

菠萝果汁常温解冻，用碳酸钠（食品级）调节其pH至5.5，经95 ℃水浴处理10 min后，在无菌条件下分别接入体积分数为1%的各种乳酸菌种子液（接种量约为6.4 lg（CFU/mL）），37 ℃培养箱中静置培养96 h，每隔24 h取样测定相应的微生物和理化指标。

1.3.4 测定方法

乳酸菌活菌数的测定：采用稀释倒平板法测定样品中的乳酸菌活菌数，具体原理和步骤参考GB 4789.2—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》乳酸菌菌落总数的测定方法。

pH值、总酸（total acids，TA）和可溶性固形物（total suspended solids，TSS）的测定：采用pH计测定样品的pH值；参考GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》方法测定样品的酸度，总酸度以乳酸计；采用台式折光仪测定样品的可溶性固形物。

总酚、VC和DPPH自由基（DPPH·）清除率的测定：总酚含量参照MSAADA K等[16]的方法进行测定；VC含量参照孙延芳等[17]的方法进行测定；DPPH自由基清除率参考吴万林等[18]的方法进行测定。

挥发性风味物质的检测：样品中挥发性风味物质参照张浩等[20]的方法进行测定。

挥发性风味物质的定性定量：挥发性风味物质利用美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）14谱库进行比对，结合参考文献[21-23]进行定性分析。利用峰面积归一化法对菠萝果汁挥发性风味物质的含量进行分析。

感官评价：样品的感官评价参照ZHANG Y等[24]的方法，组织10人感官评价小组，按照表1所给出的标准进行评价。

表1 菠萝果汁感官评价标准Table 1 Sensory evaluation standards of pineapple juice

1.3.5 数据分析

以上测定均重复3次，全部实验数据以均值±标准差表示，用Excel、SPSS 23、Origin 2017和HemI 1.0软件对实验数据进行统计分析和图形绘制。

2 结果与分析

2.1 菠萝果汁发酵过程中活菌数的变化

由图1可知，4种乳酸菌均能在菠萝果汁中正常生长；发酵0～24 h，4种乳酸菌活菌数均呈对数式上升的趋势，其中植物乳杆菌和肠膜明串珠菌的活菌数上涨较为迅速，24 h时活菌数对数值分别达到8.71和8.37；随着发酵的持续，4种乳酸菌的活菌数均呈现下降趋势，这是由于菠萝果汁中碳源物质的消耗，菌体产酸导致发酵环境的改变，从而抑制菌体的正常生长[25]；发酵终点时，除植物乳杆菌以外，其他3种乳酸菌的活菌数均低于初始活菌数。综上所述，乳酸菌发酵菠萝果汁发酵的周期以24 h最为合适。

图1 菠萝果汁发酵过程中乳酸菌活菌数的变化Fig.1 Change in viable lactic acid bacteria counts during pineapple juice fermentation

2.2 菠萝果汁发酵过程中pH、TA、TSS的变化

由图2A可知，菠萝果汁发酵期间，4种乳酸菌发酵菠萝果汁的pH值均呈下降趋势；发酵48 h后，植物乳杆菌发酵菠萝果汁的pH值持续下降，而其他3种乳酸菌发酵菠萝果汁的pH值无显著性变化，这与4种乳酸菌发酵菠萝果汁中总酸的变化趋势（图2B）相吻合。菠萝果汁发酵终点时，植物乳杆菌发酵菠萝果汁pH值为3.7，远低于其他3组，而此时植物乳杆菌发酵菠萝果汁中的总酸含量为16.14 g/L，显著高于其他3组。乳酸菌发酵菠萝果汁过程中pH值和总酸的变化趋势与之前的报道结果是一致的[26]。由图2C可知，乳酸菌发酵菠萝果汁过程中可溶性固形物含量的变化趋势与pH值的变化趋势一致；发酵0～24 h，4种乳酸菌发酵菠萝果汁中可溶性固形物的含量均呈下降趋势；发酵48 h后，4种乳酸菌发酵菠萝果汁中仅有物乳杆菌发酵菠萝果汁的可溶性固形物含量会继续下降；发酵终点时，植物乳杆菌发酵菠萝果汁中可溶性固形物含量为7.55 °Bx，显著低于其他3组。陈华丽等[15]研究发现，雪莲果汁经不同乳酸菌发酵的过程中TSS含量均呈下降趋势。以上结果表明，4种乳酸菌在菠萝果汁发酵过程中均具有产酸和消耗可溶性固形物的能力，其中植物乳杆菌产酸能力和消耗可溶性固形物的能力最强。

图2 菠萝果汁发酵过程中pH值（A）、总酸（B）和总可溶性固形物（C）的变化Fig.2 Changes in pH (A),total acid (B) and total soluble solid (C)during pineapple juice fermentation

2.3 菠萝果汁发酵过程中总酚、VC、DPPH自由基清除率的变化

酚类物质和VC是果汁中两种具有抗氧化能力的物质[27-28]，分析乳酸菌发酵菠萝果汁过程中酚类物质和VC的变化有助于解析乳酸菌发酵菠萝果汁的抗氧化能力。由图3A所示，4种乳酸菌发酵菠萝果汁中酚类物质含量在发酵过程中呈先下降后上升的趋势；在发酵0～24 h，4种乳酸菌发酵菠萝果汁总酚含量均出现一定程度的下降，这是由于多酚类物质被氧化造成的[29]；发酵24～48 h，乳酸菌能够将菠萝果汁中复杂的大分子酚类物质转化为小分子酚类物质[30]，有助于发酵菠萝果汁中总酚含量的升高，除嗜酸乳杆菌外，其他3种乳酸菌发酵菠萝果中汁中总酚含量达到了整个发酵过程中的最大值；发酵终点时，发酵果汁中总酚的含量均高于未发酵果汁。而菠萝果汁中VC的含量在整个发酵过程中均呈下降趋势（图3B），在发酵48 h和72 h，肠膜明串珠菌发酵组中VC的含量远高于其他发酵组，这表明肠膜明串珠菌保留菠萝果汁中VC含量的能力较强。

图3 菠萝果汁发酵过程中总酚（A）、维生素C（B）、DPPH自由基清除率（C）的变化Fig.3 Changes in total phenol (A),VC (B) and DPPH free radical scavenging rate (C) during pineapple juice fermentation

此外，对4种乳酸菌发酵菠萝果汁发酵过程中抗氧化活性的变化规律也进行了研究，采用DPPH自由基清除率的方法进行分析。在整个发酵过程中，4种乳酸菌发酵菠萝果汁的抗氧化活性均呈先升高后降低的趋势（图3C）；发酵24 h时，4种乳酸菌发酵菠萝果汁的抗氧化活性均高于初始发酵组，其中植物乳杆菌发酵组中的抗氧化活性达到最高，而发酵0～24 h，4种乳酸菌发酵菠萝果汁中与抗氧化活性相关的酚类物质和VC含量均呈下降趋势，这可能是由于乳酸菌发酵菠萝果汁过程中产生了其他有助于抗氧化的物质[31]；发酵48 h时，除植物乳杆菌发酵组外，其他3种乳酸菌发酵菠萝果汁的抗氧化活性也达到最高；随着发酵的进行，4种乳酸菌发酵菠萝果汁的抗氧化活性均开始下降，这主要是由于发酵菠萝果汁中酚类物质和VC含量下降，而未有其他具有抗氧化活性的物质增加而造成的。因此，适量缩短乳酸菌发酵菠萝果汁的发酵周期有助于菠萝果汁中VC含量的保留及其总酚含量与抗氧化活性的提高。

2.4 乳酸菌发酵对菠萝果汁感官品质的影响

图4 不同乳酸菌发酵菠萝果汁24 h（A）和48 h（B）的感官评价得分雷达图Fig.4 Radar chart of sensory evaluation scores of pineapple juices fermented by different lactic acid bacteria at 24 h (A) and 48 h (B)

菠萝因其独特的风味而深受消费者喜爱，因此，研究乳酸菌发酵对菠萝果汁感官品质的影响尤为必要。从乳酸菌发酵菠萝果汁的益生作用、抗氧化能力、外观等多因素进行综合考虑，选择发酵24 h和48 h的菠萝果汁进行感官评价和挥发性风味物质分析。针对发酵菠萝果汁的色泽、气味、滋味和状态进行评价（图4）。从色泽方面分析，仅肠膜明串珠菌发酵24 h的菠萝果汁组的评分高于未经乳酸菌发酵的菠萝果汁组，说明菠萝果汁经乳酸菌发酵后会影响其色泽；从气味方面分析，除嗜酸乳杆菌发酵24 h的菠萝果汁组、植物乳杆菌发酵24 h的菠萝果汁组和植物乳杆菌发酵48 h的菠萝果汁组的评分低于未经乳酸菌发酵的菠萝果汁组外，其余发酵组的评分均高于未经乳酸菌发酵的菠萝果汁组；从滋味方面分析，植物乳杆菌发酵24 h的菠萝果汁组和植物乳杆菌发酵48 h的菠萝果汁组的评分均最低，远低于未经乳酸菌发酵的菠萝果汁组，而肠膜明串珠菌发酵24 h的菠萝果汁组和肠膜明串珠菌发酵48 h的菠萝果汁组的评分普遍高于其他发酵组，这可能是因为植物乳杆菌发酵菠萝果汁过程中产生了一些不友好的风味，而干酪乳杆菌和肠膜明串珠菌则会产生一些友好的风味；从状态方面分析，植物乳杆菌发酵48 h的菠萝果汁组和肠膜明串珠菌发酵48 h的菠萝果汁组的评分高于未经乳酸菌发酵的菠萝果汁组，其他发酵组的评分跟未经乳酸菌发酵的菠萝果汁组没有显著性差异。将四方面综合分析，菠萝果汁发酵24 h时，干酪乳杆菌发酵组的评分最高；菠萝果汁发酵48 h时，肠膜明串珠菌发酵组的评分最高。

对4种乳酸菌发酵菠萝果汁中挥发性风味物质的变化也进行了研究（图5），从不同菠萝果汁中共检测到36种挥发性风味物质，其中酸类物质3种，醇类物质4种，酯类物质17种，醛类物质1种，酮类物质1种和酚类物质3种。与未发酵菠萝果汁相比，除S-48组外，其他7组乳酸菌发酵菠萝果汁中消失的挥发性风味物质种类均超过新增的，其中干酪乳杆菌发酵48 h的菠萝果汁组、植物乳杆菌发酵24 h的菠萝果汁组、植物乳杆菌发酵48 h的菠萝果汁组、嗜酸乳杆菌发酵24 h的菠萝果汁组和肠膜明串珠菌发酵24 h的菠萝果汁组中消失的挥发性风味物质均在10种以上。研究表明，酯类物质是菠萝中果香的主要贡献成分[25，32]，尽可能保留菠萝果汁中的酯类风味物质尤为重要。在未经乳酸菌发酵的菠萝果汁中共检测到的酯类物质14种，分别是丁酸甲酯、2-甲基丁酸甲酯、丁酸乙酯、戊酸甲酯、2-甲基丁酸乙酯、5-已酸甲酯、己酸甲酯、2-己烯酸甲酯、己酸乙酯、3-甲硫基丙酸甲酯、苯甲酸甲酯、3-甲硫基丙酸乙酯、4-辛烯酸甲酯、辛酸甲酯、辛酸乙酯、丙位辛内酯和癸酸甲酯。其中己酸甲酯、3-甲硫基丙酸乙酯、3-甲硫基丙酸甲酯、己酸乙酯、丁酸甲酯具有菠萝味香气，同时2-甲基丁酸甲酯、辛酸甲酯和辛酸乙酯等物质亦具有果香[7，33]。8组发酵菠萝果汁中的酯类物质数量较未发酵菠萝果汁组均呈下降趋势，其中植物乳杆菌发酵24 h的菠萝果汁组和嗜酸乳杆菌发酵24 h的菠萝果汁组中检测到的挥发性酯类物质仅有4种。此外，未发酵菠萝果汁中相对含量超过10%的酯类物质仅有2种，分别是戊酸甲酯和己酸甲酯，其中己酸甲酯的相对含量达到38.58%。经4种乳酸菌发酵的发酵菠萝果汁中均未检测到戊酸甲酯，而己酸甲酯在发酵菠萝果汁中均可检出，其中植物乳杆菌发酵48 h的菠萝果汁组中的己酸甲酯相对含量达到48.85%。此外，另一种呈菠萝味香气的酯类物质-丁酸甲酯在植物乳杆菌发酵48 h的菠萝果汁组中的相对含量高达26.87%。与此同时，3-甲硫基丙酸甲酯也普遍存在于发酵菠萝果汁中，其相对含量在经干酪乳杆菌发酵24 h的菠萝果汁组、经干酪乳杆菌发酵48 h的菠萝果汁组、植物乳杆菌发酵24 h的菠萝果汁组、嗜酸乳杆菌发酵24 h的菠萝果汁组、嗜酸乳杆菌发酵48 h的菠萝果汁组、肠膜明串珠菌发酵24 h的菠萝果汁组和肠膜明串珠菌发酵48 h的菠萝果汁组中的相对含量均超过10%，其中在肠膜明串珠菌发酵48 h的菠萝果汁组中的相对含量达到46.85%。而新产生的挥发性风味物质中，仅乙酸、已酸和对烯丙基苯酚存在于多组发酵菠萝果汁中，而其他新增物质仅存在于一种发酵菠萝果汁中。综上所述，发酵24 h时，经干酪乳杆菌发酵的菠萝果汁能够较好的保留菠萝独特风味和有利香气成分；而发酵48 h时，嗜酸乳杆菌在保留菠萝果汁独特风味和有利香气成分方面更具优势，这与感官评价的结果一致。

图5 不同乳酸菌发酵菠萝果汁中挥发性风味物质的相对含量Fig.5 Relative contents of volatile flavor substances in different pineapple juices

3 结论

菠萝果汁营养丰富，4种乳酸菌均能在菠萝果汁中正常生长，发酵24 h时，4种菠萝果汁中乳酸菌活菌数对数值均已超过6.5，其中植物乳杆菌和肠膜明串珠菌的活菌数对数值分别可达8.71和8.37，但随着发酵的延续乳酸菌活菌数出现下降趋势。4种乳酸菌均具有较强的产酸能力，其中植物乳杆菌产酸能力最强，发酵96 h时，其总酸含量达到16.14 g/L，远高于其他发酵组。此外，乳酸菌发酵菠萝果汁过程中VC含量均出现显著下降，而仅有肠膜明串珠菌能够延缓菠萝果汁中VC的流失。经乳酸菌发酵的菠萝果汁中可溶性固形物、总酚含量和抗氧化能力在发酵前期（0～24 h）均显著升高，表明乳酸菌可迅速提高菠萝果汁活性物质含量和抗氧化能力。此外，针对4种乳酸菌发酵菠萝果汁的感官品质分析中，发酵24 h的干酪乳杆菌菠萝果汁和发酵48 h的嗜酸乳杆菌菠萝果汁不仅综合感官评价较优，而且能够较好的保留菠萝果汁中主要的挥发性风味物质。综上所述，益生菌发酵菠萝果汁的周期不宜过长，适宜的发酵周期既可保留菠萝果汁独特的风味和营养价值，又可提升其益生效果。