山西老陈醋醋醅中产酸菌的分离、鉴定及醇酸耐受分析

赵馨仪，范冰倩，郑 宇，宋 佳*

（天津科技大学 生物工程学院 工业发酵微生物教育部重点实验室天津市微生物代谢与发酵过程控制技术工程中心，天津 300457）

食醋作为中国传统的酸性调味品，已经有3 000多年的历史。山西老陈醋是以高粱为主要原料，以麸皮、稻壳和谷壳为辅料，以大麦、豌豆为原料制作的大曲作为糖化发酵剂，经酒精发酵后采用固态醋酸发酵，再经熏醅、陈酿等工艺酿制而成，是中国四大名醋之首，其酿造工艺被评为国家非物质文化遗产[1-2]。山西老陈醋中含有丰富的营养物质，如：有机酸、氨基酸、还原糖、酯类、醛类、酮类、无机盐类、维生素[3-4]，具有色、香、醇、浓、酸五大特征。食醋作为调味品，除了具有酸味、鲜味、甜味和香气以外，还有增进食欲、帮助消化等保健功能。明代李时珍在《本草纲目》中记载：“醋能消肿、散火气、杀邪毒、理诸药之功效”[5]。现代科学研究表明，食醋具有杀菌消炎、抗氧化、降血压、降血脂、降血糖、护肝养肾、促进钙吸收、缓解疲劳、美容减肥等功效[6-8]。

山西老陈醋的发酵过程采用半固态和固态发酵工艺，即酒精发酵为半固态发酵，醋酸发酵为固态发酵。醋酸发酵阶段是食醋风味形成的关键阶段，多种微生物在发酵过程中富集和演替[9]。对发酵醋醅中细菌菌群研究发现，参与醋酸发酵的细菌菌群主要包括醋杆菌属（Acetobacte）、乳酸菌属（Lactobacillus）和芽孢杆菌属（Bacillus），其中醋杆菌属和乳杆菌属是醋酸发酵过程的主导菌群[2]。醋酸菌可以将酒精氧化为乙酸，是提供食醋酸味的主要微生物，且有研究证实乙酸具有降血脂、降血糖、降血压、消炎、护肝等功效[10-11]，也是赋予食醋功能性的主要微生物。乳酸是乳酸菌的主要代谢产物，能够缓解乙酸给食醋带来的刺激性，使食醋口感柔和，有助于改善食醋的风味；此外，乳酸也具有降血脂、提高免疫力、缓解酒精性脂肪肝等健康作用[12-13]，因此，乳酸菌在食醋酿造中也有至关重要的作用。芽孢杆菌可产生高度活性的蛋白酶，可以将蛋白质水解成氨基酸，这些氨基酸对食醋的风味和颜色起到重要作用，此外，芽孢杆菌对食醋活性成分之一——四甲基吡嗪的生成有一定作用[14-15]。在醋酸发酵过程中，多种微生物通过代谢产生丰富的有机酸，尤其是醋酸菌将酒精发酵阶段形成的大量乙醇转化为乙酸，为食醋提供酸味[16-18]。因此，产酸微生物对食醋的酸味形成尤为重要。同时，醋酸发酵过程中的大量的乙醇和有机酸也会对微生物生长和代谢产生影响，这就要求产酸微生物在产酸同时，还需具有较强的醇酸耐受性。因此，本研究以山西老陈醋醋酸发酵醋醅为研究对象，从中筛选产酸微生物，并进行醇酸耐受分析，以期得到高产酸和高耐受的优良菌株。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 样品

样品：山西老陈醋某醋厂醋醅。取醋酸发酵1 d、3 d、5 d、7 d和9 d的样品适量，混合均匀后作为菌种筛选的醋醅样品。

1.1.2 培养基

（1）富集培养基：葡萄糖3%，酵母膏1%，蛋白胨1%，乙醇3.5%（V/V）。

（2）分离培养基：葡萄糖3%，酵母膏1%，蛋白胨1%，碳酸钙0.5%，琼脂2.5%，乙醇3.5%（V/V）。

（3）发酵培养基

醋酸菌培养基：葡萄糖3%，酵母膏1%，蛋白胨1%，乙醇5%（V/V）。

乳酸菌培养基（MRS）：葡萄糖2%，蛋白胨1%，牛肉提取物1%，酵母提取物0.5%，无水乙酸钠0.5%，吐温80 0.1%（V/V），柠檬酸铵0.2%，磷酸氢二钾0.2%，硫酸镁0.058%，硫酸锰0.025%，pH 6.2～6.8。

1.2 仪器与设备

BS224S精密天平：北京赛多利斯仪器有限公司；Agilent 1260高效液相色谱仪（紫外检测）：美国安捷伦科技有限公司；1X2-1LLJ100普通光学显微镜：日本OLYMPUS公司；WS2-134-75电热恒温培养箱：天津市实验仪器厂；ChemiDoc TMXRS+凝胶分析仪：美国Bio Rad公司；T-1基因扩增仪：德国Eppendorf公司；XLFX-SBA-40E生物传感仪：北京中西远大科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 产酸细菌的分离纯化

取5 g醋醅置于盛有45 mL无菌生理盐水的无菌均质杯内，8 000 r/min均质2 min，取菌悬液以2%接种量接种于富集培养基。菌体富集条件为30 ℃、180 r/min振荡培养48 h。取1 mL增殖培养液，制备10倍系列稀释样品匀液。取适量系列稀释后的菌悬液涂布至分离培养基，30 ℃培养48 h，观察并记录平板中菌落形态以及是否产生透明圈。挑取长势良好、产生透明圈的典型单菌落，采用三区划线法在新的平板中进行菌种纯化。

1.3.2 分离菌株的种属鉴定

按照细菌基因组DNA提取试剂盒要求步骤提取细菌DNA。采用超微量紫外光度计测定DNA浓度和纯度。以27F/1492R为引物扩增细菌的16S rDNA，引物序列为：27F，5'-AGAGTTTGAT（C/T）（A/C）TGGCTCAG-3'；1492R，5'-TACCTTGTTA（C/T）GACTT-3'。

聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增条件为：a.94 ℃预变性3 min；b.94 ℃变性30 s；c.54 ℃退火40 s；d.72 ℃延伸100 s；e.72 ℃延伸10 min。b-d步骤循环30次。采用琼脂糖凝胶电泳法验证PCR所得16S rDNA片段大小。PCR产物送至金唯智生物科技有限公司测序。采用DNAMAN软件对测序结果（abi文件）进行拼接，去除两端质量差的两部分，所得序列以FASTA形式保存。将所得序列输入美国国家生物技术信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）网站进行序列比对，以同源性大于99%鉴定菌株种属。采用MEGA 4.0软件进行聚类分析和构建系统进化树[19-20]。

1.3.3 高产酸菌株的筛选与总酸含量的测定

将筛选菌株接种于对应发酵培养基上，于30 ℃培养培养96 h，测定发酵液中总酸含量，筛选产酸能力较高产酸菌株。总酸含量采用酸碱滴定的方法测定[21]。

1.3.4 乙醇对菌株生长的影响

（1）对醋酸菌的影响：以醋酸菌培养基为对照组，实验组的培养基初始乙醇体积分数设置为：7%、9%、11%、13%、15%，在30 ℃、180 r/min条件下振荡培养0、12 h、24 h、36 h、48 h后测定OD600nm值。

（2）对乳酸菌的影响：以MRS培养基中添加体积分数5%乙醇为对照组，实验组的培养基初始乙醇体积分数设置为：7%、9%、11%、13%、15%，在37 ℃、180 r/min条件下振荡培养0、12 h、24 h、36 h、48 h测定OD600nm值。

1.3.5 乙酸对菌株生长的影响

醋酸菌以醋酸菌培养基为对照组，实验组的培养基初始乙酸体积分数设置为：1%、2%、3%、4%，在30 ℃、180 r/min条件下振荡培养0、12 h、24 h、48 h、72 h后测定OD600nm值。

乳酸菌以MRS培养基为对照组，实验组的培养基初始乙酸体积分数设置为：1%、2%、3%、4%，在37 ℃、180 r/min条件下振荡培养0、12 h、24 h、48 h、72 h后测定OD600nm值。

2 结果与分析

2.1 产酸菌株的筛选及鉴定

2.1.1 产酸菌的分离筛选

通过涂布观察，从醋醅中分离筛选得到7株有明显透明圈、菌落形态有差异的的菌株，初步判断为产酸菌株。所有菌落形态为乳白色突起，较湿润、边缘不整齐，3株革兰氏阴性菌和4株革兰氏阳性菌，细胞形态均为杆状。依据筛选顺序命名为SAV-1、SAV-2、SAV-5、SAV-6、SAV-7、SAV-8、SAV-9。

2.1.2 菌株分子生物学鉴定

以上述7株菌的16S rDNA为模板进行PCR扩增，PCR扩增产物的琼脂糖胶电泳图如图1所示，结果表明，7株菌扩增的条带明亮、PCR扩增产物碱基长度在1500bp左右、无杂带。

图1 产酸菌株的16S rDNA PCR产物琼脂糖凝胶电泳图Fig.1 Agarose gel electrophoresis of 16S rDNA PCR products of acid producing strains

7株菌株的种属鉴定结果见表1。由表1可知，分离出的7株菌中包含4株醋酸菌（SAV-1、SAV-2、SAV-5和SAV-9）和3株乳酸菌（SAV-6、SAV-7和SAV-8）。在种水平上共有4种，其中菌株SAV-1、SAV-2和SAV-5均属于巴氏醋杆菌（Acetobacter pasteurianus），菌株SAV-9属于发霉醋杆菌（Acetobacter pomorum），菌株SAV-7和SAV-8属于植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），菌株SAV-6为乳杆菌（Lactobacillussp.）。

表1 所筛菌株的种属鉴定结果Table 1 Identification results of the screened strains

2.1.3 系统发育树的构建

采用构建系统发育树的方法对7株菌的亲缘关系远近进行分析，结果见图2。由图2可知，菌株SAV-1、SAV-2和SAV-5的亲缘关系相同，均为巴氏醋杆菌（Acetobacter pasteurianus），与16S rDNA鉴定结果一致。与菌株SAV-9亲缘关系最近的菌株为Acetobacter pomorum，与该菌株16S rDNA鉴定结果一致，所以该菌株为发霉醋杆菌（A.pomorum）。菌株SAV-7和SAV-8与乳杆菌属（Lactobacillus）亲缘关系较近，其中与植物乳杆菌（L.plantarum）亲缘关系最近且与16S rDNA鉴定结果一致。因此，SAV-7和SAV-8两株菌均为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。菌株SAV-6与乳杆菌属亲缘关系较近，在种水平上与16S rDNA鉴定结果一致，为Lactobacillussp.。

图2 基于16S rDNA产酸菌株系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rDNA of acidogenic strains

2.2 产酸能力的测定

将分离得到的这7株产酸菌接种到相应的发酵培养基中，30 ℃培养96 h后，测定发酵液中的总酸含量，结果见图3。

图3 产酸菌株的总酸产量Fig.3 Total acid production of acid producing strains

由图3可知，7株产酸菌产酸能力各不相同，其中醋酸菌（SAV-1、SAV-2、SAV-5和SAV-9）的平均产酸水平为1.97 g/100 mL，其中菌株SAV-1产酸能力最强，总酸产量为3.06 g/100mL，其次为菌株SAV-9，总酸产量为2.92g/100 mL。产酸能力最弱的醋酸菌为SAV-5，总酸产量为0.64 g/100 mL。乳酸菌（SAV-6、SAV-7和SAV-8）的平均产酸水平为1.69 g/100 mL，其中菌株SAV-7产酸能力最强，总酸产量为2.05 g/100mL，其次为菌株SAV-8，总酸产量为1.73g/100mL。产酸能力最弱的乳酸菌为菌株SAV-6，总酸产量为1.21 g/100 mL。因此，根据总酸产量高低，产酸能力较高的醋酸菌有SAV-1和SAV-9，产酸能力较高的乳酸菌有SAV-7和SAV-8。

2.3 高产酸菌株的醇酸耐受性

2.3.1 乙醇对高产酸菌株生长的影响

乙醇对高产酸菌株生长的影响见图4。由图4A可知，乙醇体积分数在5%～13%时，随着乙醇体积分数的增加，醋酸菌SAV-1的生物量呈现增加的变化趋势，但在乙醇体积分数达到15%时，醋酸菌的生物量呈现下降趋势。由图4B可知，乙醇体积分数在5%～11%时，醋酸菌SAV-9随着乙醇体积分数的增加生物量呈现上升的变化趋势，当乙醇体积分数≥13%时，生物量呈现下降的变化趋势。这可能是因为乙醇是有机化合物，较低浓度的乙醇可以作为醋酸菌的碳源和能源，有利于醋酸菌进行自身代谢和生长，而超过一定浓度范围，可能会导致细胞膜破坏，从而对细胞造成损伤，不利于细胞生长。由图4C和4D可知乙醇对乳酸菌产生抑制，随着乙醇体积分数的增加，乳酸菌的生物量呈现下降的变化趋势。乙醇对两株乳酸菌（SAV-7和SAV-8）的抑制作用较为相似，当乙醇体积分数在5%～9%时，对两株乳酸菌具有一定的抑制作用，然而，当乙醇体积分数≥11%时，对乳酸菌产生强烈的抑制作用，因此，在乙醇耐受性上，这两株乳酸菌能够耐受9%的乙醇。

图4 不同乙醇体积分数对高产酸菌株生长的影响Fig.4 Effect of ethanol volume fraction on the growth of high acid-producing strains

2.3.2 乙酸对高产酸菌株生长的影响

乙酸对4株菌株生长的影响见图5。由图5A可知，低含量的乙酸（1%）对醋酸菌SAV-1的生长有一定的促进作用。乙酸含量在2%～3%时，对菌株SAV-1的生长有一定的抑制作用，但乙酸含量达到4%时，该菌株的生物量呈现急剧下降的变化趋势，乙酸对菌株生长产生强烈抑制作用。因此，乙酸含量在3%时，该菌株具有较好的耐受性。由图5B可知，随着乙酸含量的增加，醋酸菌SAV-9的生物量呈现下降的变化趋势，当乙酸含量为1%时，对菌株SAV-9有一定的抑制作用，当乙酸含量≥2%时，该菌株的生物量急剧下降，因此，相对于菌株SAV-1，菌株SAV-9乙酸耐受性较差。由图5C和5D可知，乙酸对两株乳酸菌（菌株SAV-7和SAV-8）的影响较为相似，均是随着乙酸含量的增加，菌株的生物量呈现下降的变化趋势。当乙酸含量在1%～2%时，菌株生长虽受到抑制，生物量降低，但乳酸菌仍然能够生长，但当乙酸含量≥3%时，乙酸对乳酸菌产生强烈抑制，菌株SAV-7仅能够少量生长，而菌株SAV-8几乎不生长，因此，这两株乳酸菌能够耐受2%的乙酸。乙酸是弱有机酸，乙酸分子能够跨膜进入细胞内，且在胞内解离产生质子和醋酸阴离子，破坏细胞内环境。这可能是乙酸对微生物生长产生抑制作用的主要原因之一。

图5 不同乙酸体积分数对高产酸菌株生长影响Fig.5 Effect of different acetic acid volume fraction on the growth of high acid-producing strains

2.4 小结

综上，通过对醋酸菌和乳酸菌的醇酸耐受性分析，醋酸菌SAV-1具有较高的醇酸耐受性，能够耐受体积分数为13%的乙醇和体积分数为3%的乙酸；乳酸菌SAV-7和SAV-8均具有较高的醇酸耐受性，能够耐受体积分数为9%的乙醇和体积分数为2%的乙酸。该3株产酸菌具有高产酸性和高醇酸耐受性，可以作为潜在的食醋生产优良菌株。

3 结论

本研究从山西老陈醋醋醅中筛选得到7株产酸菌，经鉴定醋酸菌有4株，均属于醋杆菌属（Acetobacter），乳酸菌有3株，均属于乳杆菌属（Lactobacillus）。通过菌株产酸性分析、乙醇耐受性分析和乙酸耐受性分析，从中筛选获得了3株具有高产酸、高醇酸耐受性的优良菌株，分别鉴定为巴氏醋杆菌（Acetobacter pasteurianus）SAV-1、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SAV-7和SAV-8。其中巴氏醋杆菌SAV-1能够耐受体积分数为13%的乙醇和体积分数为3%的乙酸。植物乳杆菌SAV-7和SAV-8能够耐受体积分数为9%的乙醇和体积分数为2%的乙酸，是潜在的食醋生长优良菌株。