高效液相色谱法快速测定白酒中8种吡嗪类化合物

龙四红，廖妍俨*，孙 棣，陈学航，黄家岭，李红洲，梁桂娟

（贵州省产品质量检验检测院 国家酒类及加工食品质量监督检验中心，贵州 贵阳 550016）

吡嗪是一种1,4位含氮类的六元杂环化合物，它的衍生物广泛存在于天然和发酵食品中[1-2]。近年来对白酒中风味物质的研究发现，虽然吡嗪类化合物在白酒中的含量甚微，但其具有风味阈值低，香气透散性好，并对其他香味物质有明显的烘托叠加作用等特点，对白酒的风味起着重要的作用[3-4]。尤其是白酒中的四甲基吡嗪（川芎嗪）由美拉德反应生成，在制曲和堆积发酵的过程中产生，经蒸馏带入酒中，具有扩张血管、改善微循环及抑制血小板集聚等作用，赋予中国白酒健康功能[5-6]。所以对白酒中吡嗪类化合物的分析检测显得尤为重要。

目前国内外对吡嗪类化合物的分离方法主要有液液萃取（liquid-liquid extraction，LLE）、固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）[7-8]、顶空固相微萃取（headspace solidphasemicroextraction，HS-SPME）[9-10]、离子交换（ionexchange，IEX）和超临界萃取（supercritical fluid extraction，SFE）等[11]，检测方法主要有气相色谱（gas chromatography，GC）法[12]、气质联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法[13-15]和气相色谱氮磷检测器（gas chromatography-nitrogen phosphorusdetector，GC-NPD）等[16-17]。王莉等[18]建立了一种利用气相色谱-质谱-选择离子扫描（gas chromatography-mass spectrometry-selectiveionmonitoring，GC-MS-SIM）联用技术，该方法只定量分析了白酒中4种重要化合物；张艳红等[19]采用顶空固相微萃取与气相色谱-火焰热离子检测器（solidphase microextraction-gas chromatography-flame thermionic detector，SPME-GC-FTD）相结合的方法，定量了8种吡嗪类化合物；孙棣等[20]采用液相色谱-质谱联用法快速测定酱香型白酒中的8种吡嗪类化合物。以上方法需要大量的有机试剂，样品用量大，且步骤过于繁琐，预处理过程中被分析物损失较大。白酒中吡嗪的高效液相色谱-荧光检测法（high performance liquid chromatography-fluorescence detection，HPLC-FLD）尚鲜见报道。

本研究建立一种高效液相色谱（HPLC）快速测定白酒中8种吡嗪类化合物含量的方法，并对该方法进行方法学考察，并对高效液相色谱（HPLC）条件优化、样品前处理方法研究，采用高效液相色谱（HPLC）仪对白酒样品中吡嗪类化合物进行检测，旨在得到检测白酒中8种吡嗪类化合物的快速、有效方法，该方法建立对白酒中吡嗪类化合物的评价有重要的现实意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

白酒样品：某白酒生产企业提供。

2-甲基吡嗪（纯度＞99%）、2,5-二甲基吡嗪（纯度＞98%）、2,6-二甲基吡嗪（纯度98%）、2,3-二甲基吡嗪（纯度99%）、2-乙基-6-甲基吡嗪（纯度95%）、2,3,5-三甲基吡嗪（纯度＞99%）、2,3,5,6-四甲基吡嗪（纯度＞98%）：上海安谱科学仪器有限公司；2,3-二甲基-5-乙基吡嗪（纯度＞98%）：山东省滕州市华东生物科技有限公司。其他试剂均为国产分析纯或色谱纯。

1.2 仪器与设备

Aglient-1260高效液相色谱仪（配有光电二极管阵列检测器（diode-array detector，DAD）和荧光检测器（FLD））：美国安捷伦公司；TurboVap LV氮吹仪：瑞典Biotage公司；EYELA NYC-2100旋转蒸发仪：东京理化器械株式会社；Milli-Q Academic超纯水系统：密理博（中国）有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 高效液相色谱分析条件

流动相由流动相A和流动相B组成，流动相A：乙腈；流动相B：0.1%磷酸水溶液（pH=2.1）；梯度洗脱流动相设置见表1。Phenomenon Gemini 5μ C6-Phenyl 110A色谱柱（250 mm×4.6 mm）；柱温：30 ℃；流速：1 mL/min；进样量：10 μL；荧光检测器条件：激发波长280 nm，发射波长348 nm。

表1 梯度洗脱条件Table 1 Gradient elution conditions

1.3.2 对照品溶液的制备

分别精确称取2-甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪、2,3-二甲基-5-乙基吡嗪对照品各100 mg，用乙醇溶解定容，得质量浓度为10 mg/mL的标准储备液，将标准溶液用蒸馏水分别稀释至0.1 μg/mL、0.2 μg/mL、0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、5.0 μg/mL，用于HPLC分析。

1.3.3 样品前处理

取白酒样品10 mL于具塞50 mL离心管中，用12 mol/L NaOH调pH为12，再用1 mol/L NaOH调pH为14，加适量NaCl使其饱和，15 mL乙醚振荡萃取15 min，重复提取2次，收集乙醚层，70 ℃水浴蒸发至剩余约0.5 mL，再以纯水定容至1 mL，过0.45 μm滤膜后用于HPLC进样分析。

1.3.4 方法学考察

（1）精密度试验

将2 μg/mL的混标连续进样6次，按1.3.1色谱条件测定8种吡嗪类化合物峰面积，分别计算结果相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。

（2）重复性试验

精密称取同一份白酒样品6份，按1.3.3的方法进行前处理，进样10 μL，测定8种吡嗪类化合物峰面积，计算结果相对标准偏差（RSD）。

（3）加标回收率试验

用无水乙醇配制体积分数为53%的乙醇溶液，作为空白酒样，加入不同质量浓度的吡嗪标准品进行加标回收试验，根据白酒中8种吡嗪化合物含量的高低，其中2-甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪分别添加0.1 mg/kg、0.2 mg/kg、0.5 mg/kg三个不同水平质量浓度，另外5种吡嗪分别添加0.5 mg/kg、1.0 mg/kg、2.0 mg/kg三个不同水平质量浓度。

2 结果与分析

2.1 高效液相色谱条件优化

2.1.1 色谱柱的选择

首先选择了实验室液相色谱分析常用的Agilent ZORBAX Extend-C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，3.5 μm）、Agilent ZORBAX SB-C8色谱柱（4.6 mm×100 mm，3.5 μm），因为分析的8种吡嗪类化合物均为烷基取代化合物，其中2,3-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪为同分异构体，在C18、C8色谱柱上的保留时间非常接近。经多次尝试不同厂家不同型号的液相色谱柱后，发现菲罗门苯基色谱柱Gemini 5 μ C6-Phenyl 110A（250 mm×4.6 mm），使用了特殊的硅胶-有机层作为填料，具有增加碱性化合物保留和pH适应范围广（pH 1～12）功能，与吡嗪为弱碱性化合物的特点相适应，也满足流动相pH较低的条件。因此，选择菲罗门苯基色谱柱Gemini 5 μ C6-Phenyl 110A（250 mm×4.6 mm）。

2.1.2 检测器的选择

由图1可知，采用DAD检测器，在波长275 nm处测试8种吡嗪类化合物的对照品溶液均能得到较好的响应和较低的检出限，但在测试样品过程中，发现有一个很大的干扰峰，主要是由于二极管阵列检测器选择性较差，且白酒中含有大量的醇类、酯类、酚类等物质，这些物质大多都有紫外吸收，因此出现了干扰峰。

图1 采用二极管阵列检测器时样品色谱图Fig.1 Chromatogram of sample by diode array detection

由图2可知，在改用FLD检测器后该干扰峰变低且分离效果好。因此，最终确定采用FLD检测器，激发波长280 nm，发射波长348 nm。

图2 采用荧光检测器时样品色谱图Fig.2 Chromatogram of sample by fluoressence detector

2.1.3 流动相的选择

图3 乙腈-水（5∶95）为流动相时8种吡嗪类化合物标液色谱图Fig.3 Chromatogram of 8 pyrazine compounds standard solution using acetonitrile-water (5∶95) as mobile phase

为得到简单易得，分离度高，分析时间短的流动相系统，分别对甲醇-水（10∶90，V/V）、甲醇-缓冲盐（乙酸铵）（5∶95，V/V）、乙腈-水（5∶95，V/V）、乙腈-缓冲盐（乙酸铵）（5∶95，V/V）、甲醇-手性添加剂（β-环糊精）（10∶90，V/V）、乙腈-手性添加剂（β-环糊精）（10∶90，V/V）等不同的流动相系统进行了多次摸索，结果见图3。由图3可知，8种吡嗪类化合物在乙腈-水（5∶95，V/V）系统中分离效果良好。因此，采用乙腈-水（5∶95，V/V）系统作为流动相。

2.1.4 流动相中pH值的确定

在用液相色谱柱进行吡嗪类化合物的分离时，发现吡嗪类化合物对流动相的pH值很敏感。在乙腈-水（5∶95，V/V）的流动相系统中，加入0.1%的磷酸溶液调节流动相pH值，在pH值为1.9时，吡嗪类物质出峰时间较早，峰形较好，但2,3-二甲基吡嗪和2,6-二甲基吡嗪不能完全分离；pH上升到2.1时，8种吡嗪能得到良好的分离效果（见图4）；当pH上升至2.2时，2,5-二甲基吡嗪和2,6-二甲基吡嗪出现包裹现象且与2,3-二甲基吡嗪不能完全分离。因此，选择流动相pH值为2.1。

图4 乙腈-水（5∶95）为流动相在pH值为2.1时8种吡嗪类化合物标液色谱图Fig.4 Chromatogram of 8 pyrazine compounds standard solution using acetonitrile-water (5∶95) as mobile phase at pH 2.1

2.1.5 流动相流速的选择

图5 流速为1.0 mL/min时8种吡嗪化合物色谱图Fig.5 Chromatogram of 8 pyrazine compounds at a flow rate of 1.0 ml/min

设置柱温30 ℃，以乙腈-水（pH 2.1）溶液为流动相，考察流速分别为0.5 mL/min、0.8 mL/min、1.0 mL/min、1.2 mL/min、1.5mL/min时的分离情况，发现流速为1.0mL/min的分析效果良好（见图5）。流速越低，分析时间延长，峰形变差；随着流速的升高，分析时间明显缩短，但影响分离度，综合分离度和分析时间。因此，选择流速为1.0 mL/min。

2.1.6 柱温的选择

在流速为1.0 mL/min时，分别设置柱温为25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃，发现8种吡嗪类物质的分离效果没有明显区别。因此，设置柱温为常用的30 ℃。

综上，优化的HPLC色谱条件为：检测器为FLD，色谱柱为Phenomenon Gemini 5 μ C6-Phenyl 110A（250 mm×4.6 mm）；柱温30 ℃，流动相A为乙腈，B为%0.1磷酸水溶液（pH=2.1），梯度洗脱；流速为1 mL/min。标准品及样品的HPLC分析色谱图分别见图6。由图6可知，在此优化色谱条件下，标准品及样品吡嗪类物质分离良好。

图6 8种吡嗪类物质标准品（a）及白酒样品（b）的HPLC色谱图Fig.6 HPLC chromatogram of 8 pyrazine compounds of standards (a) and Baijiu samples (b)

2.2 样品前处理方法研究

为建立回收率高，成本低，操作简单，重现性好的前处理方法，进行了3种方式前处理方法研究，结果见表2。

表2 样品不同前处理方法优缺点的比较Table 2 Comparison of advantages and disadvantages by different sample pretreatment methods

由表2可知，方法一采用直接蒸发浓缩的方法，前处理虽然简单，但不能有效去除白酒中的酸、酯、醇等物质的干扰，且不能对目标化合物进行有效富集，回收率较低。方法二采用的是将样品先酸化，浓缩后进行液-液萃取，再碱化的步骤，目的是先使样品中的目标化合物呈离子化，再用有机溶剂萃取掉样品中的酸、酯、醇等干扰物质，但此方法耗时长，有机溶剂消耗大，操作复杂，回收率不高。方法三是在碱性条件使样品中的吡嗪类物质更好的溶解在乙醇中，再用乙醚将样品中的吡嗪萃取出来，经过无水硫酸钠干燥后，不经过旋转蒸发器（减少旋蒸过程的损失），直接用离心管在70 ℃的水浴条件下将样品挥发至约0.5 mL，再用纯水定容至1 mL。

图7 按方法三前处理白酒样品中8种吡嗪类物质色谱图Fig.7 Chromatogram of 8 pyrazine compounds in Baijiu samples according to pretreatment method 3

由图7可知，方法三前处理过程得到分析样品具有干扰物质少，回收率高的特点，平均回收率可达到86%以上。因此，选择方法三作为酒样前处理方法。

2.3 标准曲线线性方程、线性范围、相关系数和检出限

将配制好的标准溶液按最佳色谱条件进样分析，以标准溶液质量浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为横坐标，绘制标准曲线，得到8种吡嗪物质的标准曲线线性方程、线性范围、相关系数见表3。

表3 8种吡嗪化合物的线性方程、线性范围、相关系数及检出限Table 3 Linear equation,linear range,correlation coefficient and limit of detection of 8 pyrazine compounds

由表3可知，在0.5～5.0 μg/mL质量浓度范围内具有良好的线性关系，线性相关系数R2均在0.99以上，可满足准确定量的要求。以S/N=3确定检出限（limit of detection，LOD），其中2,3,5,6-四甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2-乙基-6甲基吡嗪的LOD均为0.10 μg/mL、2-甲基吡嗪的LOD为0.05 μg/mL、2,3-二甲基吡嗪LOD为0.15 μg/mL、2,5-二甲基吡嗪的LOD为0.24 μg/mL、2,6-二甲基吡嗪、2,3-二甲基-5-乙基吡嗪的LOD为0.13 μg/mL。

2.4 精密度试验

将2 μg/mL的混标按2.1确定的色谱条件连续进样6次，计算RSD，结果见表4。

由表4可知，2,3,5-三甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪、2,3-二甲基-5-乙基吡嗪、2-乙基-6甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3-二甲吡嗪、2,5-二甲基吡嗪和2-甲基吡嗪的精密度试验结果的RSD范围均在1.04%～2.49%之间，表明该方法的精密度良好。

表4 8种吡嗪化合物分析的精密度试验结果Table 4 Results of the precision experiments of 8 pyrazine compounds analysis

2.5 重复性试验

精密称取同一份白酒样品6份，按2.2确定的前处理方法处理样品后，取10 μL进样，根据HPLC的分析所得峰面积分别计算RSD，结果见表5。

表5 8种吡嗪化合物的重复性试验结果Table 5 Results of the reproducibility experiments of 8 pyrazine compounds

由表5可知，得到2,3,5,6-四甲基吡嗪、2-甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2,3-二甲吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,3-二甲基-5-乙基吡嗪、和2-乙基-6甲基吡嗪的RSD分别为3.06%、2.78%、2.49%、2.62%、1.82%、2.71%、3.83%、1.98%。结果表明，该方法的重复性良好。

2.6 加标回收率试验

加标回收率及RSD结果见表6。由表6可知，8种吡嗪类物质的平均回收率在86.7%～99.0%之间，表明该方法的准确度高，因而使用本研究优化的色谱条件测定白酒中8种吡嗪时可以满足试验要求。

表6 8种吡嗪化合物的加标回收率结果Table 6 Results of the standard recovery of 8 pyrazine compounds

2.7 部分白酒样品中吡嗪类物质的含量测定

用所建立的方法对31个具有代表性的酒样中吡嗪化合物含量进行了测定，结果见表7。

由表7可知，四甲基吡嗪在21个酒样中含量排在第一位，在7个酒样中含量排在第二位，在3个酒样中含量排在第三位；三甲基吡嗪在18个酒样中含量排在第二位，在7个酒样中含量排在第一位，在6个酒样中含量排在第三位；2,6-二甲基吡嗪在31个酒样中排在前三位的占30个。结果表明，该方法可以用于白酒中8中吡嗪物质的检测。

表7 白酒样品中吡嗪化合物的含量测定结果Table 7 Results of pyrazine compounds contents in Baijiu samples

续表

3 结论

通过高效液相色谱试验条件优化、样品前处理方法研究，建立了高效液相色谱-荧光检测测定白酒中8种吡嗪类化合物含量的方法，最佳色谱条件为Phenomenon Gemini 5 μ C6-Phenyl 110A色谱柱（250 mm×4.6 mm）；流动相A为乙腈，B为0.1%磷酸水溶液（pH=2.1），梯度洗脱；流速为1.0 mL/min；荧光检测器条件：激发波长280 nm，发射波长348 nm。该方法对8种吡嗪类化合物的精密度、重复性及加标回收率试验结果相对标准偏差（RSD）分别为1.04%～2.49%及1.82%～3.83%，样品加标回收率为86.7%～99.0%，检出限为0.05～0.24 μg/mL。该方法准确度高、精密度好，操作简便，成本低，可用于白酒中吡嗪类化合物的日常检测。