HPLC-示差折光检测法测定白酒中三氯蔗糖的方法研究

赵云龙

（昆明市食品药品检验所 昆明市食品药品检验研究院，云南 昆明 650032）

三氯蔗糖又称蔗糖素，是以蔗糖为原料经氯代衍生而成的一种非营养性甜味剂[1]。其性质稳定、热值低、甜度是蔗糖的600～700倍[2-3]，我国自1997年批准使用，如今已被广泛运用于各类食品中。近年来研究发现，三氯蔗糖及其水解产物具有一定的毒性，长期摄入或摄入过量会对人体生理机能造成伤害[4-11]，严格管控三氯蔗糖的安全使用势在必行。

白酒是我国的传统蒸馏酒，酿造、饮用历史源远流长。在GB 2760—2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》中规定白酒中不得添加三氯蔗糖[12]，但白酒生产历史由古至今，生产作坊标准不一、工艺参差不齐、管理不到位、食品安全意识淡薄，部分生产者为改善口感，掩盖酒体的酸苦涩杂味，非法人为添加三氯蔗糖等添加剂。改进并建立简单快速有效的检测方法，有利于促进白酒行业的健康发展[13-14]。

目前文献报道中，三氯蔗糖的测定方法有高效液相色谱-质谱法[15-21]、气相色谱法[22]、滴定法[23]、固相萃取法[24-25]、高效液相色谱法[26-31]、毛细管电泳法[32]、离子色谱法[33-35]等。这些方法或过程繁琐，或仪器昂贵，或分析时间长。目前采用高效液相色谱-示差折光检测法测定三氯蔗糖的研究尚少。本研究通过从不同维度、不同梯度进行逐一实验分析，从而确定高效液相色谱-示差折光检测法测定白酒中三氯蔗糖的最适宜条件。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

三氯蔗糖标准品（99.7%）：德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；乙腈（色谱纯）：美国Avantor公司；0.22 μm有机相滤膜：天津津腾实验设备有限公司。

1.2 仪器与设备

Waters bridge C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）：美国沃特世科技有限公司；1260 Infinity高效液相色谱仪（配示差检测器G1362A）：美国安捷伦科技有限公司；MS 105DU十万分之一电子天平：美国METTLER TOLEDO公司；arium®comfort Ⅱ纯水超纯水一体机：德国赛多利斯集团。

1.3 实验方法

1.3.1 标准溶液配制

准确称取三氯蔗糖标准品0.050 00 g（精确至0.000 01 g）于50 mL容量瓶中，加纯水定容至刻度，摇匀，得到质量浓度为1.00 g/mL标准中间液。根据需要，取适量中间液用纯水逐级稀释至适当浓度的标准工作液。

1.3.2 实验步骤

采用高效液相色谱示差法，从流动相比例、流速、进样量、柱温、示差检测池温度五个方面、不同梯度进行考察。分别考察不同体积分数的乙腈溶液（11%、15%、20%、25%、30%），流速（0.6 mL/min、0.8 mL/min、1.0 mL/min、1.2 mL/min、1.4 mL/min）、进样量（10 μL、15 μL、20 μL、25 μL、30 μL）、柱温（20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃）、检测池温度（20 ℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45 ℃）对试验结果的影响，取6次的平均值进行统计分析，综合实验成本和检测效率等因素，确定高效液相色谱示差法测定白酒中三氯蔗糖的最佳色谱条件。

1.3.3 试样制备

试样经0.22 μm有机相微孔滤膜过滤，直接取滤液上机分析。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 流动相的选择

在流速1.0 mL/min、进样量20 μL、柱温35 ℃、示差检测池温度35 ℃时，分别配制体积分数分别为11%、15%、20%、25%、30%五个梯度的乙腈水溶液（混合），考察流动相中乙腈体积分数与三氯蔗糖保留时间的关系，每个梯度做6次平行实验，取6次的平均值绘图，结果见图1。

图1 流动相中乙腈体积分数与三氯蔗糖保留时间的关系Fig.1 Relationship between acetonitrile volume fraction and retention time of sucralose in mobile phase

由图1可知，三氯蔗糖保留时间随着流动相乙腈体积分数的增加而减小。当乙腈体积分数＜20%时，三氯蔗糖保留时间呈现明显减小趋势。当乙腈体积分数＞20%时，三氯蔗糖保留时间减小趋势变缓。当乙腈体积分数＞25%时，三氯蔗糖保留时间减小趋势甚微。在色谱峰稳定的前提下，保留时间越短越好。选择乙腈∶水=（20∶80，V/V）为适宜流动相。

2.1.2 流动相流速的选择

在流动相为乙腈∶水=（20∶80，V/V）、进样量20 μL、柱温35 ℃、示差检测池温度35 ℃时，分别设定0.6 mL/min、0.8 mL/min、1.0 mL/min、1.2 mL/min、1.4 mL/min五个梯度流速，考察流速与三氯蔗糖保留时间和色谱峰面积的关系，每个梯度做6次平行实验，取6次的平均值绘图，结果见图2。

图2 流动相流速与三氯蔗糖保留时间、峰面积的关系Fig.2 Relationship between mobile phase velocity and retention time and peak area of sucralose

由图2可知，三氯蔗糖保留时间和色谱峰面积随着流动相流速的增加而呈现平缓减小趋势。当流动相流速低时，色谱峰面积大，说明分析灵敏度高，但保留时间相对要长，操作成本高且耗时。当流动相流速高时，色谱峰面积小，说明分析灵敏度有所降低。综合考虑，选择1.0 mL/min为适宜流动相流速，既可以保证分析灵敏度，又可以适当缩短分析时间，提高分析效率。

2.1.3 进样量的选择

在流动相为乙腈∶水=（20∶80，V/V）、流速1.0 mL/min、柱温35 ℃、示差检测池温度35 ℃时，分别设定10 μL、15 μL、20μL、25μL、30 μL五个梯度进样量，考察进样量与三氯蔗糖保留时间和色谱峰面积的关系，每个梯度做6次平行实验，取6次的平均值绘图，结果分别见图3、图4。

图3 进样量与三氯蔗糖保留时间的关系Fig.3 Relationship between injection volume and retention time of sucralose

图4 进样量与峰面积的关系Fig.4 Relationship between injection volume and peak area

由图3和图4可知，三氯蔗糖保留时间和色谱峰面积随着进样量的增加而增加。当进样量＞20 μL时的三氯蔗糖保留时间和色谱峰面积的线性较进样量10～20 μL时的线性呈现出明显的波动，说明分析灵敏度有所降低。综合考虑，选择20 μL为适宜进样量。

2.1.4 柱温的选择

在流动相为乙腈∶水=（20∶80，V/V）、流速1.0 mL/min、进样量20 μL、示差检测池温度35 ℃时，分别设定20 ℃、25 ℃、30℃、35℃、40℃五个梯度柱温，考察柱温与三氯蔗糖保留时间的关系，每个梯度做6次平行实验，取平均值，结果见图5。

图5 柱温与三氯蔗糖保留时间的关系Fig.5 Relationship between column temperature and retention time of sucralose

由图5可知，三氯蔗糖保留时间随着柱温的升高而减小。柱温升高，物质传递速率加快，保留时间缩短，分析灵敏度提高。但柱温过高会造成物质传递速率过快，影响组分的分离，同时可能会造成柱子内部结构坍塌，损坏柱子。综合考虑，选择35 ℃为适宜柱温。

2.1.5 检测池温度的选择

在流动相为乙腈∶水=（20∶80，V/V）、流速1.0 mL/min、进样量20 μL、柱温35 ℃时，分别设定20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃六个梯度检测池温度，考察示差检测池温度与三氯蔗糖保留时间的关系，每个梯度做6次平行实验，取平均值，结果见图6。

图6 检测池温度与三氯蔗糖保留时间的关系Fig.6 Relationship between RID cell temperature and retention time of sucralose

由图6可知，示差检测池温度与三氯蔗糖保留时间之间并未有明显的线性关系。当检测池温度低于35 ℃和高于40 ℃时，保留时间线性极不稳定。当检测池温度35～40 ℃时，保留时间呈现相对稳定趋势。综合考虑，选择35 ℃为适宜检测池温度。

综合上述实验，高效液相色谱法分析三氯蔗糖的适宜色谱条件为流动相乙腈∶水=（20∶80，V/V）、流速1.0 mL/min、进样量20 μL、柱温35 ℃、示差检测池温度35 ℃。

2.2 标准曲线建立及方法验证

2.2.1 标准曲线的绘制

配制0.01 mg/mL、0.02 mg/mL、0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL系列三氯蔗糖标准溶液，在上述适宜条件下进行分析，以三氯蔗糖保留时间定性、以峰面积定量，得到标准曲线见图7。由图7可知，三氯蔗糖回归方程为：y=149 669x-106，相关系数R2=0.999 94。可见，三氯蔗糖质量浓度在0.01～0.4 mg/mL范围内呈现出较好的线性关系。

图7 三氯蔗糖溶液的标准曲线Fig.7 Standard curve of sucralose solution

2.2.2 检出限和定量限

配制适宜浓度的三氯蔗糖标准溶液，在上述适宜色谱条件下平行测定3次，分别按照信噪比（signal to noise ratio，S/N）=3和S/N=10计算出方法检出限和定量限，结果见表1。

表1 方法检出限和定量限Table 1 Detection limit and quantification limit of the method

由表1可知，该方法测定白酒中三氯蔗糖，其检出限为3.538 μg/mL，定量限为11.79 μg/mL，均小于食品安全国家标准GB 22255—2014《食品安全国家标准食品中三氯蔗糖（蔗糖素）的测定》[36]。

2.2.3 精密度实验

配制7组不同质量浓度的三氯蔗糖溶液，每组浓度分别做7个平行样，每个样品平行测定3次，取3次的平均值，计算得到标准偏差和相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）值，结果见表2。

表2 精密度试验结果Table 2 Results of precision tests

由表2可知，7组不同浓度的三氯蔗糖溶液涵盖了标线的整个线性范围，从低浓度到高浓度，每一浓度的7个平行样重复性较好。三氯蔗糖测定结果的相对标准偏差（RSD）在0.6%～6.6%之间，表明该方法精密度良好，且浓度越高，精密度相对越好。

2.2.4 加标回收率试验

取3组空白样，分别加入质量浓度为0.012 6 mg/mL、0.037 6 mg/mL、0.126 4 mg/mL三氯蔗糖标准溶液1 mL。每组做7个平行样，每个样品平行测定3次，取3次的平均值，计算加标回收率及其RSD值，结果见表3。

表3 加标回收率试验结果Table 3 Results of standard recovery rate tests

由表3可知，三氯蔗糖的加标平均回收率为96.3%～103.4%，其RSD值为1.0%～2.8%，表明该方法准确度高，满足GB 27404—2008《实验室质量控制规范食品理化检测》[37]要求。

2.2.5 样品测定

随机选取市售10个白酒试样，每个试样做两个平行样，分别吸取适量，经0.22 μm滤膜过滤，取滤液直接上机。在上述适宜色谱条件下，每个样品平行进样3次。10个白酒试样均未检出三氯蔗糖，符合GB 2760—2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》[12]规定。

3 结论

采用高效液相色谱示差法测定白酒中三氯蔗糖含量的方法，使用C18色谱柱（5 μm，4.6 mm×150 mm），在流动相乙腈∶水=（20∶80，V/V）、流速1.0 mL/min、进样量20 μL、柱温35 ℃、示差检测池温度35 ℃条件下，三氯蔗糖在质量浓度0.01～0.40mg/mL范围内，线性关系好，相关系数R2=0.99994。在上述适宜条件下进行分析测定，结果表明，精密度试验结果相对标准偏差在0.6%～6.6%之间，检出限为3.538 μg/mL，定量限为11.79μg/mL，加标平均回收率为96.3%～103.4%。该方法简单快捷，定量准确，适用于白酒中三氯蔗糖含量的大规模、大批量快速检测。