二仙汤治疗高血压的网络药理学研究

朱 颖，李丹丹，吉 洁，梅 俊，徐凤芹

我国高血压患病率逐年上升，但仍未得到很好的控制。最近一次调查结果显示我国35～75岁的成年人中近一半患有高血压，其中只有不到三分之一的病人正在接受治疗[1]，成年高血压病人中有超过2.6亿的病人血压未得到有效控制[2]。

中医中药在高血压治疗方面具有多效性、多靶点、前瞻性、稳定性等优点，中药具有协同降压、改善症状、改善情绪、改善代谢、提高生活质量、增效减毒、靶器官保护、减/撤西药等作用[3-4]。二仙汤是20世纪中叶上海中医药大学张伯讷教授的经验方，主要用于治疗妇女绝经前后诸病[5]。方中仙茅、淫羊藿为君药，巴戟天为臣药，佐以黄柏、知母，以当归为使，此方温补与泻热合用，壮阳与滋阴并施，旨在温补肾精、调理阴阳。有研究表明，二仙汤对于更年期高血压有较好的疗效[6]。但目前尚未见二仙汤治疗高血压的药效物质基础及分子生物机制研究。

近年来，网络药理学广泛应用于中医药的研究中，其基于系统生物学，通过与生物信息学等学科相结合，从多成分、多靶点、多通路角度阐明中药方剂治疗复杂疾病的潜在分子机制[7]。故本研究旨在用网络药理学的方法分析二仙汤治疗高血压的潜在靶点，并初步探讨其作用机制，为下一步实验提供支持与思路。

1 资料与方法

1.1 二仙汤活性化合物的筛选 口服生物利用度(OB)是客观评价药物质量的一个重要指标，一般口服生物利用度值越高，在临床应用的可能性越大[8]。药物相似度(DL)是指化合物与已知药物的相似性，具有类药性的化合物不一定是药物，但具有成为药物的可能性[9]。这两个指标常被用作化合物活性筛选，故在中药系统药理学数据库和分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)数据库(http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)以OB≥30%、DL≥0.18的条件下[10]，分别筛选淫羊藿、仙茅、巴戟天、黄柏、知母、当归6味中药的化学成分作为候选药效成分。

1.2 二仙汤潜在靶点预测及成分靶点网络构建 在TCMSP数据库中进一步检索候选药效成分得到潜在靶点，在Uniprot数据库中替换为标准基因名，以Excel形式保存为Data文件和表型文件，通过Cytoscape 3.6.1软件构建二仙汤成分-靶点网络图。

1.3 高血压疾病靶点预测 以“hypertension”为关键词，分别检索TTD、基因功能富集分析平台(CTD)、Drugbank数据库得到高血压靶点信息，在Uniprot数据库进行蛋白基因名转换。

1.4 网络相互作用与分析 分别将二仙汤成分靶点和高血压疾病靶点数据导入在线蛋白质互作(STRING)数据库(https：//string-db.org/version 11.0)，将物种(organism)设置为“Homo sapiens”，分析获得蛋白质-蛋白质相互作用图(PPI)。并将互作图中信息保存为tsv格式导入Cytoscape 3.6.1软件，构建疾病靶点网络图。用Cytoscape 3.6.1软件的混合(merge)功能将两个网络图合并，得到二仙汤-高血压共同靶点图。按照Betweeness和节点自由度(Degree)同时大于均值的标准筛出关键靶点[11]。

1.5 基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集可视化分析 将网络互作得到的药物-疾病共同靶点基因导入David数据库，进行注释及KEGG通路富集分析，并利用R3.6.3分别以柱形图和高级气泡图进行可视化。

2 结 果

2.1 筛选预测结果 根据OB≥30%、DL≥0.18条件，淫羊藿筛选后纳入23种成分，仙茅筛选后纳入7种成分，知母筛选后纳入15种成分，黄柏筛选后纳入37种成分，巴戟天筛选后纳入20种成分，当归筛选后纳入2种成分，共筛选得到91种药效成分，去除未查到靶点的成分，共得到78种候选药效成分，列出Degree值排名前10位的成分信息(见表1)以及144个潜在靶点。以“hypertension”为检索词，TTD数据库共检索到高血压靶点17个，CTD数据库共检索到高血压靶点222个，Drugbank数据库共检索到高血压靶点170个，合并去重后共得到高血压相关靶点基因333个。

表1 二仙汤部分候选药效成分信息

2.2 网络构建结果

2.2.1 二仙汤成分-靶点网络构建 将二仙汤成分靶点Excel表导入Cytoscape 3.6.1软件中，得到二仙汤成分-靶点网络图(见图1)，该网络共包含节点222个，边1 498条，其中78个节点代表药效成分，144个节点代表药效成分相关潜在靶点。应用Cytoscape软件“network analyze”功能对网络进行分析，网络平均Degree数为13.50，然而在网络中部分节点比其他节点更集中，在网络图中有很多成分与多个靶点相连接，槲皮素如(quercetin，Degree=80)、山柰酚(kaempferol，Degree=52)，这也印证了中药多成分、多靶点的作用特点。根据 Degree值降序排列，排名居前的成分有槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、去水淫羊藿素等，这些可能是主要药效成分。同样，网络图中也有同一靶点来自多个活性成分，如雌激素受体1(ESR1，Degree=64)、雄激素受体(AR，Degree=62)、前列腺素内源性过氧化物合酶1(PTGS2，Degree=52)。

图1 二仙汤成分-靶点网络图

2.2.2 PPI网络构建 分别将二仙汤潜在靶点和高血压疾病靶点导入STRING数据库，得到各自蛋白互作图，保存高血压靶点蛋白互作图(见图2)。将两个互作信息分别导入Cytoscape 3.6.1软件得到相应网络图，Merge两个网络图得到二仙汤-高血压共同靶点图(见图3)，该网络包含53个节点、336条边，其中53个节点代表二仙汤和高血压的共同靶点基因，这些可能是二仙汤治疗高血压的潜在靶点，根据Degree和Betweeness Centrality同时大于均数的标准筛选得到6个关键基因，分别为雄激素受体(AR，Degree=62)、前列腺素内源性过氧化物合酶1(PTGS2，Degree=52)、活化型一氧化氮合酶(eNOS，Degree=22)、肿瘤坏死因子(TNF，Degree=6)、转录因子AP-1(JUN，Degree=6)、细胞肿瘤抗原P53(TP53，Degree=5)。网络图根据Betweeness Centrality值渐变设置填充颜色和节点及标签字体大小，关键基因表现为三角形节点，椭圆形节点为其他共同靶点基因。

图2 高血压靶点蛋白互作图

图3 二仙汤-高血压共同靶点图

2.3 KEGG通路富集分析结果 将53个共同靶点基因导入David数据库，得到57条KEGG通路，根据P值升序排列，选取前15条通路，利用R3.6.3将通路作成气泡图可视化，纵坐标代表通路，横坐标代表P值大小，圆点越靠近纵轴，P值越小，即基因在这条通路上显著性越高，圆点的大小代表基因数，圆点越大则该条通路上基因数越多。详见图4。可以看出，53个共同靶点显著富集于多条与高血压相关的通路上，如神经活性配体-受体相互作用(neuroactive ligand-receptor interaction)、TNF信号通路(TNF signaling pathway)、PI3K-Akt信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)、环鸟苷酸-蛋白激酶G信号通路(cGMP-PKG signaling pathway)、癌症通路(pathways in cancer)等。

图4 KEGG通路富集分析气泡图

2.4 GO富集分析结果 将53个共同靶点基因导入David数据库，保存MF、CC、BP的信息，根据基因数占比排序，利用R3.6.3制成柱形图。详见图5。可以看出二仙汤治疗高血压可能与信号转导(signal transduction)、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录正调控(positive regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promoter)、对药物的反应(response to drug)、对缺氧的反应(response to hypoxia)、基因表达的正调控(positive regulation of gene expression)等生物过程相关。

图5 GO富集分析柱形图

3 讨 论

二仙汤是现代经验方，临床应用广泛，有研究表明其适用于阴阳失调引起的高血压[12]，但具体作用机制仍有待研究。本研究运用网络药理学方法探索二仙汤治疗高血压潜在药效成分、作用靶点及信号通路。二仙汤中补肾中药淫羊藿、仙茅、巴戟天补肾气，以固五脏之本，配上泻热中药黄柏、知母及补血和血之当归调理各脏腑气血阴阳，以调和高血压阴阳失调症状。既往研究表明淫羊藿、巴戟天有效成分有一定降压效果，淫羊藿次苷Ⅱ具有降低自发性高血压大鼠血压作用，且能抑制心肌细胞凋亡[13]。

本研究通过在TCMSP数据库中根据OB、DL值等指标检索，得到候选药效成分及相关作用靶点，再进一步借助软件对二仙汤成分靶点信息进行网络分析，从网络图中得到关键的药效成分，其中槲皮素、去水淫羊藿素、β-谷甾醇、山柰酚等Degree值排名靠前，可能为二仙汤中降压的主要药效成分。槲皮素已被证实能作用于心血管系统且有降压作用，有研究表明其能通过改善血管内皮依赖性松弛、抑制收缩反应起到降压作用[14]。既往文献记载淫羊藿素能通过促血管生成，改善内皮功能障碍治疗高血压[15]。β-谷甾醇具有降脂、抗炎、抗肿瘤、镇痛等多种药理作用[16]，其可能通过抑制炎症反应发挥降压作用。山柰酚可以通过舒张血管起到降压作用[17]。通过PPI网络构建得到二仙汤和高血压的53个共同靶点基因，根据Degree和Betweeness Centrality同时大于均数的标准筛选得到6个关键靶点基因，分别为eNOS、TNF、TP53、AR、JUN、PTGS2。eNOS是存在于内皮细胞的内皮型一氧化氮合酶(NOS)，NOS以L-精氨酸为底物，利用氧合成一氧化氮(NO)。NO通过cGMP介导的信号转导途径参与血管平滑肌舒张，NO生物利用度的降低会导致内皮功能障碍与高血压的形成[18]。TP53是一种抑癌基因，可以控制细胞生长和引发细胞凋亡。有研究结果表明miR-31a-5p和TP53是候选miRNA和高血压调节基因，而TP53则是miR-31a-5p的虚拟靶基因，其结合位点位于未翻译的TP53 3′(3′UTR)区域，miR-31a-5p通过加速动脉平滑肌增殖靶向TP53抑制细胞凋亡，从而参与高血压的发生发展[19]。TNF会使体内内皮素-1(ET-1)等缩血管物质分泌增多，NO等舒张血管因子分泌减少，引起小动脉痉挛，血压升高[20]。有动物实验结果表明，雄激素/AR信号会加重大鼠高血压，而抗雄激素治疗可以降低大鼠血压，证明AR与高血压形成可能有一定关系[21]。有研究表明，PTGS2与女性高血压的发病关系密切[22]。为进一步探讨二仙汤潜在作用机制，本研究利用David数据库对共同靶点基因进行富集得到可能作用的信号通路。研究发现，神经活性配体-受体相互作用通路[23]、TNF信号通路[24]、PI3K-Ak信号通路[25]、环鸟苷酸-蛋白激酶G信号通路(cGMP-PKG通路)[26]等是高血压发病机制中重要的通路。除此之外，富集分析结果显示二仙汤治疗高血压与信号转导、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录正调控、对药物的反应、对缺氧的反应、基因表达的正调控等生物过程相关。

本研究运用网络药理学技术对二仙汤治疗高血压的机制进行了系统分析，初步探索了二仙汤治疗高血压的活性成分、潜在作用靶点和潜在作用通路，为临床应用提供了药效物质基础和研究方向，同时也为中药治疗高血压提供了新的思路，但其具体作用机制有待进一步实验验证。