DPPH、ABTS和FRAP微量法测定山奈酚的抗氧化能力*

王 荣，罗 倩，冯 怡

(西安医学院药学院，陕西 西安 710021)

山奈酚是一类从蔬菜水果及中药材中提取得到的黄酮醇类物质，其具有抗氧化、抗癌、防治糖尿病、保护损伤细胞等多种功能[1]。研究显示，山奈酚具有较强的抗氧化活性，可作为抗氧化剂添加在药物中。已有文献报道山奈酚能够通过清除活性氧、保护抗氧化酶的活性抑制活性氧诱发人红细胞的溶血[2]。但目前未有实验评估山奈酚对自由基的清除活性及其总抗氧化能力。

目前对抗氧化物质的体外活性评价方法主要有自由基(DPPH自由基、ABTS自由基、超氧阴离子自由基、羟基自由基等)清除实验，脂质过氧化抑制实验和总抗氧化能力的测定等评价方法。本实验基于酶标仪-微孔板，建立微量DPPH自由基清除、ABTS自由基清除和总抗氧化能力测定法，从以上三个方面验证山奈酚的体外抗氧化作用，为其作用抗氧化剂的应用提供科学依据。

1 材 料

1.1 药品与试剂

山奈酚标准品(含量95.5%，批号110861-201611)，中国食品药品检定研究院；抗坏血酸(Vc)(纯度99%)，北京索莱宝科技有限公司；DPPH(1,1-二苯基-2-苦肼基自由基)(纯度97%)，上海思域化工科技有限公司；ABTS([2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐])(纯度98%)，萨恩化学技术有限公司；总抗氧化能力(T-AOC)测试盒，南京建成生物工程研究所；无水乙醇，天津市河东区红岩试剂厂。

1.2 仪 器

全波长酶标仪，美国Thermo Fisher Scientific公司；分析天平，奥豪斯仪器有限公司。

2 方法与结果

2.1 DPPH·清除能力的测定

2.1.1 DPPH·标准曲线的绘制

避光称取DPPH粉末82 mg，无水乙醇定容于50 mL量瓶中，得1.64 mg/mL的DPPH母液。以无水乙醇为溶剂将上述母液稀释至0.0615、0.05125、0.041、0.03075、0.0205 mg/mL。517 nm处测定其吸光度，以浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制DPPH标准曲线。结果DPPH溶液在0.0205～0.0615 mg/mL范围内与吸光度呈良好的线性关系，其回归方程为y=11.4156x+0.1717，相关系数R2=0.9945。

2.1.2 山奈酚对DPPH·清除能力

称取适量山奈酚，加入无水乙醇配制成浓度为160 μmol/L的溶液，后用无水乙醇稀释成浓度梯度为160、80、40、20、10、5、2.5 μmol/L的溶液。精密吸取梯度样品溶液100 μL和0.1 mmol/L的DPPH溶液100 μL为实验组，对照组用100 μL无水乙醇代替DPPH溶液，以加入100 μL DPPH溶液和100 μL无水乙醇为标准组，避光反应30 min，之后用酶标仪在517 nm下测定吸光度。以Vc为对照。以上实验重复三次。由式(1)计算清除率，计算IC50值:

DPPH清除率=[1-(A实验组-A对照组)/A标准组]×100%

(1)

Vc和山奈酚对DPPH自由基的清除率与浓度呈正相关。IC50的数值可衡量被测抗氧化剂的半抑制浓度。IC50值越小，表明抗氧化活性越强。山奈酚的浓度为20 μmol/L时，清除率达47.86%，浓度为80 μmol/L时，清除率则高达88.83%，其IC50为16.17 μmol/L。Vc的清除能力较强，在浓度约为56 μmol/L时清除率就可达93.63%，Vc的IC50为9.57 μmol/L。显示山奈酚对DPPH自由基有一定的清除能力。

2.2 ABTS·清除能力的测定

避光称取ABTS自由基粉末30 mg，加超纯水8 mL溶解，得7.0 mmol/L的ABTS水溶液。秤取10 mg K2S2O8加15 mL超纯水溶解，将以上二种溶液按体积比1：1等量混合，制备ABTS·+母液，置于4 ℃冰箱保存10～12 h，备用。使用时，用无水乙醇稀释至吸光度在0.7±0.02 Abs范围内即可。配制30 μmol/L山奈酚溶液，无水乙醇稀释成浓度梯度分别为30、15、7.5、3.75、1.875、0.9375 μmol/L的溶液。精密吸取梯度样品溶液100 μL和ABTS水溶液100 μL为实验组，对照组用100 μL无水乙醇代替ABTS水溶液，以加入100 μL ABTS水溶液和100 μL无水乙醇为标准组，每个浓度设置3个复孔。避光反应30 min，之后用酶标仪在734 nm下测定吸光度。以Vc为对照。以上实验重复三次。由式(2)计算清除率，计算IC50值。

ABTS清除率=1-[(A实验组-A对照组)/A标准组]×100%

(2)

ABTS在氧化剂过硫酸钾作用下被氧化成绿色的阳离子自由基ABTS·+，在抗氧化剂存在时，ABTS·+的产生会被抑制，从而使反应体系颜色变浅，在734 nm处所测吸光度值变小，通过测定吸光度值的变化即可判断样品抗氧化能力的大小。Vc与山奈酚对ABTS自由基清除率与浓度均呈正相关，当浓度为15 μmol/L时，清除率可达54.25%，浓度为30 μmol/L时，清除率可高达90.12%，山奈酚的IC50为6.97 μmol/L。而Vc的浓度约为56 μmol/L时，清除率为99.84%，Vc的IC50为6.78 μmol/L，山奈酚对ABTS自由基具有较好的清除能力。

2.3 总抗氧化能力(FRAP法)的测定

2.3.1 FeSO4-7H2O标准曲线的绘制

精密称取27.8 mg FeSO4-7H2O标准品，超纯水溶解定容至1 mL，得浓度为100 mmol/L的母液，以水为溶剂将上述母液稀释至0.15、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mmol/L。593 nm处测吸光度，以吸光度值为横坐标，对应的标准品浓度为纵坐标制成FeSO4-7H2O标准曲线。结果表明，FeSO4-7H2O溶液在0.15～1.5 mmol/L范围内，其浓度与吸光度呈现良好的线性关系，其方程为y=3.5563x+0.1898，其相关系数R2=0.991。

2.3.2 山奈酚的总抗氧化能力

避光称取山奈酚标准品适量，配制浓度为5 mmol/L的山奈酚乙醇溶液，后用无水乙醇稀释成浓度梯度分别为500、250、125、62.5、31.25、15.625 μmol/L的溶液。测定以上样品的吸光度，根据标准曲线求得与标准品相同吸光度值下的样品浓度。山奈酚的总抗氧化能力用标准物质FeSO4溶液的浓度来表示。

表1显示了不同浓度的山奈酚的总抗氧化能力。结果表明随山奈酚溶液浓度增大其总抗氧化能力增大。当山奈酚浓度在15.625～62.5 μmol/L时，其总抗氧化能力差异较小。当山奈酚浓度在125～500 μmol/L时，其总抗氧化能力显著提高。

表1 山奈酚的总抗氧化能力

3 结 论

本研究分别建立了微量化DPPH自由基清除能力测定法、ABTS自由基清除能力测定法和铁离子还原/抗氧化力测定法(FRAP)评价山奈酚的体外抗氧化活性[3]。该方法建立在酶标仪和微孔板基础之上，微孔板的使用可大幅降低试剂的消耗，酶标仪可在短时间内快速同时测定样本，显著缩短了实验周期[4-6]，该方法具有微量化、快速、准确性好等特点。

DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由基是一种以氮为中心的稳定有机自由基，它的稳定性来源于三个苯环的空间障碍和共振稳定作用，使夹在中间的氮原子上未成对电子不能发挥其应有的电子成对效应。其乙醇溶液显紫色，在517 nm处有最大吸收峰，当有抗氧化剂存在时，孤电子被配对，DPPH自由基溶液的颜色变浅，吸光度值变小，根据吸光度的变化可测得抗氧化剂的清除能力[7]。ABTS[2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐]自由基在适当的氧化剂(过硫酸钾、重铬酸钾等)作用下氧化成绿色的自由基阳离子ABTS·+，当有抗氧化物质存在时，ABTS·+的产生会被抑制，使反应体系褪色，吸光度值变小，在734 nm处测定吸光度即可计算出药物的清除能力[8]。总抗氧化能力的测定，利用“FRAP”法，在酸性条件下，抗氧化剂与Fe3+-TPTZ反应，使其还原成蓝色的Fe2+-TPTZ，在593 nm处测定吸光度，可以计算出抗氧化物质的总抗氧化能力[5,9]。以上评价方法均选用VC进行对照，从而来评价山奈酚抗氧化活性的强弱。本研究结果显示，山奈酚

对DPPH自由基和ABTS自由基具有良好的清除作用，其IC50分别为16.17 和6.97 μmol/L，山奈酚对DPPH自由基的清除作用弱于阳性药VC(P<0.05)，但其对ABTS自由基的清除作用与VC相当(P>0.05)；500 μmol/L山奈酚的总抗氧化能力为1.04 mmol/L。以上表明山奈酚具有一定的体外抗氧化能力。