克拉霉素及其杂质KL和KO的电喷雾串联质谱分析

蒋可志，金 勇，王兆刚，付君平，秦欣荣，侯仲轲，潘远江

(1.浙江大学化学系，浙江 杭州 310007；2. 浙江国邦药业有限公司，浙江 绍兴 312369)

克拉霉素又称6-O-甲基红霉素A，学名为5-(4-二甲胺四氢-3-羟基-6-甲基-2-吡喃氧基)-6-甲氧基-11,12,13-三羟基-2,4,6,8,10,12-六甲基-9-氧代-3-(四氢-5-羟基-4-甲氧基-4,6-二甲基-2-吡喃氧基)十五烷酸-μ-内酯，属于14元环大环内酯类抗生素[1-2]。克拉霉素适用于鼻咽感染、下呼吸道感染、皮肤软组织感染、急性中耳炎、肺炎、尿道炎及宫颈炎等感染症状的治疗，对链球菌属、肺炎球菌、葡萄球菌等革兰阳性菌的抗菌作用略优于红霉素，对诱导产生的红霉素耐药菌株也具有一定的抗菌活性[3-5]。

克拉霉素属于微生物类次级代谢产物衍生物，其存在大量杂质，即使是全球最大的大环内酯类原料药生产商(浙江国邦药业有限公司)所生产的克拉霉素药品也存在需进一步分析个别微量杂质结构。电喷雾串联质谱技术具有快速、灵敏以及直接分析混合物等优点，在杂质结构分析中受到重视[6-8]。

本工作拟对克拉霉素及其杂质KL和KO进行电喷雾串联质谱研究，总结质谱碎裂规律，以期为相关的杂质结构推导提供参考。

1 实验部分

1.1 仪器与装置

Agilent 1260系列高效液相色谱仪：美国Agilent公司产品；micro TOF-QII电喷雾四极杆-飞行时间质谱仪：德国Bruker公司产品。

1.2 样品和试剂

克拉霉素(K)及其杂质KL、KO：浙江国邦药业有限公司产品，化学结构示于图1。甲醇、甲酸：色谱纯，美国Sigma-Aldrich公司产品；水为去离子水，电阻率大于18.2 MΩ·cm；用于准确质量校正的PEG1000溶液由本实验室制备。

图1 克拉霉素(a)及其杂质KL(b)、KO(c)的结构式Fig.1 Structures of clarithromycin (a) and its impurities KL (b), KO (c)

1.3 实验条件

使用甲醇-水溶液(1∶1，V/V)将待测物溶解并稀释至10 mg/L，通过注射泵以3 μL/min注入电喷雾离子源，在正离子模式下离子化，以PEG1000为外标溶液对仪器进行准确质量轴校正。仪器操作参数：雾化气为氮气，压力20 kPa；干燥气为氮气，流速2 L/min；干燥气温度250 ℃；毛细管电压-4.5 kV；在二级质谱实验中，碰撞气体为氩气，目标离子的质量选择窗口4 u，碰撞诱导解离(CID)碰撞能量18 eV。使用Analysis version 4 软件进行数据处理。

1.4 量化计算

量化计算软件为Gaussian 03程序[9]，采用半经验理论MP3基组进行结构优化和频率计算。完成结构优化后，进行反应物、中间物和产物的结构频率计算时不存在虚频；而过渡态结构存在唯一的振动虚频和合理的振动模式，并且通过内禀反应坐标(IRC)计算确认。本工作研究对象的结构非常复杂，存在许多构象，为获得相对最优结构，采用分子动力学软件对某一优化结构进行动力学模拟，获得若干个初始优化结构，并将能量最低的结构作为相对最优结构。本文采用电子和热自由能的总和进行能量讨论，所优化的结构由Gaussview软件(3.09版本)显示。

2 结果与讨论

2.1 克拉霉素的质谱碎裂研究

克拉霉素原样的液相色谱图示于图2，K及其杂质KL和KO的出峰时间分别为12.71、9.92、17.17 min。经ESI电离，K、KL和KO均容易产生[M+H]+，即m/z748.484 2、763.494 1、777.510 0，确定其化学式分别为C38H70NO13+、C38H71N2O13+和C39H73N2O13+。采用高分辨Q-TOF技术对[M+H]+离子进行二级质谱分析，结果示于图3，相关离子的质荷比、丰度以及元素组成等信息列于表1。

以K为例解析质谱碎裂规律。克拉霉素质子化离子的质谱碎裂类似于多肽的流动质子模式碎裂，带电质子可以在其柔性结构中各碱性位点间迁移，当带电质子迁移到解离质子化位点时，会诱导相应的碎裂反应[10-12]。克拉霉素结构中存在许多碱性位点，包括氨基N、羰基O、醚键O和羟基O。其中，氨基N和羰基O的气相碱度明显大于醚键O和羟基O，量化计算结果示于图4。克拉霉素氨基N质子化所形成的离子K5c的自由能比酮羰基O质子化离子K1和酯羰基O质子化离子K9的自由能分别低41.8、51.6 kJ/mol，表明克拉霉素的最优质子化位点在氨基N上。因此，克拉霉素经ESI电离后，带电质子主要结合在氨基N上，形成质子化离子K5c。经碰撞活化后，克拉霉素质子化离子中带电质子开始从氨基N向各解离质子化位点迁移，并引发相应碎裂。

图2 克拉霉素原样的液相色谱图Fig.2 HPLC spectrum of the raw clarithromycin sample

注：碰撞能量18 eV图3 克拉霉素(a)及其杂质KL(b)、KO(c)的[M+H]+离子高分辨串联质谱图Fig.3 Accurate MS/MS spectra of clarithromycin (a) and its impurities KL (b) and KO (c)

开环碎裂至少涉及2个化学键的断裂，克拉霉素的大环内脂骨架上只有1个解离质子化位点(O原子)，故其不容易发生骨架开环碎裂，质谱碎裂优先发生在侧链上，如大环骨架的6、5、3号位上的醚键O。

由于带电质子主要结合在大环骨架5号位吡喃环的氨基N上，故先从5号位侧链基团碎裂入手研究克拉霉素质子化离子K5c的碎裂规律。克拉霉素骨架上5号位侧链脱氧氨基糖苷基团的质谱断裂存在2种途径，示于图5。在path-1中，K5c克服93.9 kJ/mol的能垒使其带电质子从氨基N迁移到5a位O原子上，形成异构离子K5a，同时自由能增加82.2 kJ/mol。K5a只需跨越6 kJ/mol的能垒就可以发生i-断裂，并通过丢失大环内酯单元产生含吡喃环结构的碎片离子K5a-P(m/z158.1)。在path-2中，K5c需克服106.6 kJ/mol的能垒使带电质子迁移到5b位O原子上，形成异构离子K5b，同时自由能增加94.6 kJ/mol。K5b继续克服17.2 kJ/mol的能垒发生电荷诱导的C—O键断裂，从而产生异构离子K5b2。K5b2继续克服54.9 kJ/mol的能垒发生i-断裂，引发脱氧氨基糖苷单元开环反应，产生亚胺结构碎片离子K5b-P(m/z116.1)，克拉霉素大环5号侧链质谱碎裂的反应势能面示于图6。Path-1碎裂途径的累积能垒为93.9 kJ/mol，远小于path-2的159.8 kJ/mol，表明path-1碎裂途径更易发生，即碎片离子K5a-P丰度为100%，而K5b-P丰度仅为9.6%，与表1的实验结果相符合。

克拉霉素及其杂质大环6号侧链发生的质谱碎裂途径示于图7。当带电质子迁移到6a位的O原子上，形成异构离子K6a。K6a发生电荷诱导的丢失甲醇反应，产生碎片离子m/z716.5，其途径为：1) 直接丢失形成碎片离子K6a-P1；2) 邻基参与反应，即5号位上吡喃环的邻位羟基亲核进攻6号位C发生闭环反应并丢失甲醇分子，产生碎片离子K6a-P2。在K6a-P1离子结构中，正电荷定域在6号C上，而在K6a-P2离子结构中，正电荷以带电质子的形式迁移到碱性位点上，其自由能比K6a-P1克拉霉素及其杂质大环发生在3号侧链上的质谱碎裂途径示于图8。当带电质子迁移到3a位O原子上，形成异构离子K3a，存在2种碎裂途径：1) 5号位侧链糖基上的羟基O5d原子亲核进攻K3a的3号位侧链糖基C3b原子，并发生O3a—C3b键断裂，从而实现了3号位侧链上糖基基团的迁移，形成异构体K3a2，K3a2上的带电质子迁移到O5a原子后发生i-断裂，通过丢失大环内酯单元产生碎片离子K3a-1P(m/z316.2)；2) 3号位侧链糖基上的对位羟基O3c原子亲核进攻C3b原子，发生O3a—C3b键断裂，产生离子-中性复合物K-INC，其是由丢失3号侧链糖基的克拉霉素(K3a-2P)与带双环结构的脱水吡喃糖类质子化离子(3P)两部分组成。K3a-2P结构中含有叔胺N，其质子亲和势高于3P，所以在K-INC分离之前，3P的带电质子迁移到K3a-2P的叔胺N上，然后产生碎片离子K3a-2P(m/z590.4)。K3a-2P与K5c结构相似，也能发生丢失甲醇的碎裂反应，产生碎片离子K3a-2P-P(m/z558.4)。

表1 克拉霉素及其杂质的高分辨串联质谱图中碎片离子信息Table 1 Accurate MS/MS data of clarithromycin and its impurities KL and KO

图4 克拉霉素氨基N(a)和酮羰基O(b)、酯羰基O(c)质子化离子的优化结构Fig.4 Optimized structures of the N-protonated and the carbonyl O-protonated clarithromycin

图5 克拉霉素及其杂质大环5号侧链发生的质谱碎裂途径Fig.5 Fragmentation pathways of protonated K, KL and KO at the No.5 side chain group

图6 克拉霉素大环5号侧链质谱碎裂的反应势能面Fig.6 Potential energy surface for fragmentation of protonated clarithromycin at the No.5 side chain group

图7 克拉霉素及其杂质大环6号侧链发生的质谱碎裂途径Fig.7 Fragmentation pathways of protonated K, KL and KO at the No.6 side chain group

图8 克拉霉素及其杂质大环3号侧链发生的质谱碎裂途径Fig.8 Fragmentation pathways of protonated K, KL and KO at the No.3 side chain group

2.2 克拉霉素杂质KL和KO的质谱碎裂反应

杂质KL和KO是克拉霉素分别与羟胺或甲氧基胺缩合反应产生的，二者与克拉霉素具有非常相似的碎裂途径：在高质量区存在相同的特征中性丢失，如丢失CH4O(32 u)、C8H12O3(158 u)、(C8H12O3+CH4O)(190 u)；在低质量区存在相同的碎片离子，如m/z316.2、158.1、116.1等。

此外，由于杂质KL和KO大环结构中肟基上的O是一个碱性位点，可以促进带电质子在整个离子结构中的迁移，并引发相应的碎裂反应，所以会产生更多的碎片离子。比如，杂质KL质子化离子在丢失3号侧链基团(KL3a-2P)后，还会继续丢失5号侧链基团产生碎片离子m/z448.3(12.5%)；杂质KO质子化离子会连续丢失3号和5号侧链基团，产生碎片离子m/z462.3(1.4%)。

3 结论

本研究将串联质谱技术和量化计算相结合，系统地研究了克拉霉素及其杂质KL和KO的质谱碎裂规律。量化计算结果表明，克拉霉素结构中的最优质子化位点为5号侧链单元氨基N原子，其质子化离子经碰撞活化后发生一系列质子迁移和侧链基团的碎裂反应：1) 带电质子分别迁移到5号侧链基团O5a和O5b上，引发丢失大环内酯单元或脱氧氨基糖苷开环反应，产生特征离子5a-P(m/z158.1)和5c-P(m/z116.1)；2) 带电质子迁移到6号侧链基团O6，并引发丢失甲醇，产生碎片离子6a-P；3) 带电质子迁移到3号侧链基团O3a，引发由5号侧链单元O5d亲核取代而导致吡喃糖单元迁移，并丢失大环内酯单元产生特征离子3a-1P(m/z316.2)，也可发生由对位羟基O3c亲核取代引发的吡喃糖单元丢失碎裂，产生特征离子3a-2P，并继续丢失甲醇分子产生特征离子3a-2P-P。本研究可为相关大环内酯类抗生素的杂质结构推导提供参考。