白芷-川芎药对镇痛作用研究

覃文玉 杨丹淇 张源文 王映雪 刘 杨，2 刘 明，2*

1.贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025；2.贵州中医药大学中药、民族药药理作用及作用机制研究中心，贵州 贵阳 550025

2015年版《药典》收载的“都梁丸”由白芷、川芎(白芷：川芎=4:1)组成，具有祛风散寒、活血通络的功效，用于风寒瘀血阻滞脉络所致的头痛，症见头胀痛或刺痛、痛有定处、反复发作、遇风寒诱发或加重[1]。现代药理研究表明，白芷-川芎药对的镇痛作用显著[2-3]，但其镇痛的作用机制不明。笔者采用醋酸致小鼠扭体实验，观察白芷-川芎药对的镇痛及其调节大脑神经递质表达的作用。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF级KM小鼠42只，雌雄各半，体重18～22 g，购于湖南省长沙市天勤生物技术有限公司，许可证号：SCXK(湘)2014-0011。

1.2 药物与试剂 白芷，购买于贵州药材市场，经贵州中医药大学生药教研室吴之坤副教授鉴定为川白芷Angelicadahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.f.的根；川芎，购买于贵州药材市场，经贵州中医药大学生药教研室吴之坤副教授鉴定为川芎LigusticumchuanxiongHort.的根茎；阿司匹林肠溶片(批号：201904178，辰欣药业股份有限公司)；醋酸(批号：20181217，湖南尔康制药股份有限公司)；5-HT、PGE2试剂盒(批号分别为：NO.20190725B、NO.20190723A，武汉博士德公司)；DA抗体(批号：NO.ab19316，Abcam公司)。

1.3 仪器 680型全自动酶标仪(美国BIO-RAD公司)，电泳仪和凝胶成像系统(BIO-RAD公司)。

1.4 方法

1.4.1 药物制备 取白芷10 g，川芎2.5 g(2015年版《药典》收载的白芷、川芎单用量均为3～10 g，本研究选择白芷10 g∶川芎2.5 g=4∶1作为都梁丸的处方，人的体重按照60 kg计算，则人日用都梁丸为生药量12.5 g/60 kg，小鼠剂量设为 2.08 g/kg，相当于人用量的10倍。)，参照文献方法[4]，经70%乙醇渗漏提取，回收乙醇，浓缩，4 ℃冰箱保存备用。

1.4.2 醋酸致小鼠扭体实验 取KM小鼠42只，随机分为3组，即正常对照组、白芷-川芎药对组、阿司匹林组，雌雄各半，每组14只。灌胃给予相应的药物，20 mL/kg，每日1次，连续7次，正常对照组给予等容量的生理盐水灌胃。末次给药0.5 h，每只小鼠腹腔注射0.6%的醋酸溶液 0.2 mL，立即计时，观察记录注射醋酸后15 min内小鼠出现的扭体次数，并计算镇痛百分率。

镇痛百分率(%)=(正常对照组平均扭体次数-给药组平均扭体次数)/正常对照组平均扭体次数×100%

1.4.3 ELISA检测脑组织5-HT、PGE2含量 注射醋酸后30 min，处死小鼠，分离大脑，随机取7只小鼠的大脑加9倍的预冷生理盐水匀浆，3500 r/min离心20 min，取上清，按照试剂盒说明书检测5-HT、PGE2含量。

1.4.4 Western blot检测脑组织DA蛋白表达 另取7只小鼠大脑，液氮冻存，根据试剂盒说明，做大脑总蛋白提取后，BCA法蛋白定量。按试剂盒操作步骤制备浓度12%分离胶和浓度5%浓缩胶，80 V电压电泳2 h后60 V电压转膜2 h，5%脱脂奶粉封闭1 h后加Ⅰ抗，β-actinⅠ抗浓度1∶6000、DAⅠ抗1∶500，Ⅰ抗4℃孵育过夜后加入Ⅱ抗1∶10000，室温孵育2 h，TBST冲洗3次，ECL显影，上机检测，以β-actin作为内参，灰度分析。

2 结果

2.1 白芷-川芎药对对小鼠扭体反应的影响 白芷-川芎药对组能明显减少扭体次数，其镇痛百分率达到60.9%，高于阿司匹林组的51.3%，表明白芷-川芎药对具有明显的镇痛作用。见表1。

表1 白芷-川芎药对对醋酸所致小鼠扭体反应的影响

2.2 白芷-川芎药对对小鼠大脑组织5-HT、PGE2含量的影响 白芷-川芎药对组能明显增加小鼠时脑组织中5-HT的水平，减少PGE2的含量。见表2。

表2 白芷-川芎药对对小鼠大脑组织5-HT、PGE2含量的影响

2.3 白芷-川芎药对对小鼠大脑组织DA表达的影响 白芷-川芎药对组能明显增加小鼠脑组织中DA的表达。见表1、如图1所示。

表3 白芷-川芎药对对小鼠大脑组织DA表达的影响

3 讨论

白芷是一味历史悠久且应用十分广泛的中药，始载于《神农本草经》，被列为中品，味辛、苦、温，归肝、肾、膀胱经，有解表散寒、祛风止痛、宣通鼻窍、燥湿止带、消肿排脓的功效，同时有消瘀、止血、通便等作用，可用于治疗风寒感冒、阳明头痛、眉棱骨痛、风湿痹痛等症，是治疗阳明经头痛的要药[5]。川芎，别名芎藭、生川军、香果，辛温香燥，走而不守，既能行散，上行可达巅顶；又入血分，下行可达血海，常用于活血行气，祛风止痛之证[6]。白芷、川芎均为祛风止痛之药，均可上行头目并分别入太阳经和阳明经。古方以白芷一味为都梁丸洽诸风眩晕，偏正头痛甚佳。近代都梁丸则含白芷、川芎两味，用于头痛眩晕，眉棱骨痛，僧寒发热。诸多止头痛方中含白芷、川芎药对[7]。

身体的疼痛通常是指由身体损伤、病患或不良的外部刺激所引起的不舒服感觉[8]。出于临床的需要，国际疼痛研究协会将疼痛定义为“由真正存在或潜在的身体组织损伤所引起的不舒服知觉和心理感觉”。尽管疼痛发病机制复杂，但已有的研究表明，神经递质在疼痛的发生、发展过程中占据重要的地位。PGE2是一种重要的细胞生长和调节因子，是前列腺素的一种，也是一种重要的疼痛递质之一，存在于动物和人体中，其过量增加会引起疼痛产生。5-HT是一种抑制性神经递质，其含量增加也能减少疼痛。DA是大脑中含量最丰富的儿茶酚胺类神经递质，是内源性含氮有机化合物，其蛋白含量表达增加能够兴奋大脑，起到减轻疼痛的作用[9]。尽管一般认为，扭体法适合评价外周镇痛，热板法适合评价中枢镇痛，但也有研究表明[10]在醋酸致小鼠扭体实验中，小鼠大脑组织中PGE2含量显著下降，故本研究选择小鼠扭体实验观察白芷-川芎药对对脑神经递质含量的影响。

本研究结果显示，白芷-川芎药对具有明显的减少醋酸致小鼠扭体反应数，降低脑组织中PGE2的含量，增加脑组组中5-HT含量及DA蛋白表达水平，这与相关的报道一致，提示白芷-川芎药对发挥镇痛作用可能是通过调节脑内神经递质，从而影响疼痛递质的水平而产生镇痛作用。课题组后续将继续深入研究白芷-川芎药对镇痛的物质基础和作用机制。课题组后续将继续深入研究白芷-川芎药对镇痛的部位、物质基础和作用机制。