C型尿钠肽的作用机制及其对动物生殖调控的研究进展

荆 天，字向东

（西南民族大学动物科学国家民委重点试验室，四川 成都 610041）

C型尿钠肽（C-type natriuretic peptide，CNP）是Sudoh等[1]首次在猪脑中提纯的小分子蛋白，从属于尿钠肽家族。尿钠肽家族成员还包括心房尿钠肽（atrial natriuretic peptide，ANP）、脑钠肽（brain natriuretic peptide，BNP）和树突尿钠肽（dendrite natriuretic peptide，DNP），广泛分布于心脏、下丘脑、垂体、肺和肾等组织，在维持心血管内稳态、血压和体液调节方面发挥重要作用[2-3]。CNP主要在生殖系统中表达[4]。研究表明，在小鼠卵母细胞体外成熟（in vitro maturation，IVM）前阶段，补充CNP和雌二醇可以使减数分裂停滞，并且囊胚发育率高于传统体外成熟的卵母细胞；在牛和羊的IVM前阶段，补充CNP可以提高囊胚的产量和质量[5-6]。CNP通过作用于环磷酸鸟苷（cGMP）控制环磷酸腺苷（cAMP）浓度，从而促进卵母细胞发育能力，提高囊胚发育率[7-9]。文章综述CNP的作用机制及其在动物生殖调控中的研究进展，以期深化对CNP作用机制的认识，提高家畜繁殖能力。

1 C型尿钠肽的结构

CNP由22个氨基酸组成，与同属于尿钠肽家族的ANP、BNP和DNP高度同源，均是由17个氨基酸组成的环状结构，但CNP缺乏羧基末端延伸（见图1[10]）。编码CNP的人类基因NPPC位于2号染色体2q24-qter位置，包含3个外显子：外显子1编码23个信号肽和CNP原的前7个氨基酸；外显子2编码其余的CNP原序列；外显子3编码3’非翻译区。CNP前原肽由126个氨基酸组成，被切割成23和103个氨基酸，其中23个氨基酸组成信号肽，103个氨基酸被进一步加工成CNP-53[11]。CNP-53可以以CNP-22前30～31位置的Lys-Lys为信号转化为CNP-22，二者同时存在。CNP-53通常是主要的内源分子组织形式，CNP-22则是主要的成熟形式[3]。Peng等[12]对不同物种的尿钠肽前原肽序列进行比较，发现CNP前原肽物种间同源性显著高于ANP、BNP和DNP，CNP被认为使该家族中最保守的尿钠肽。

2 C型尿钠肽受体结构及转导机制

目前发现3种结构的尿钠肽受体，分别为A型尿钠肽受体（natriuretic peptide receptor A，NPR-A）、B型尿钠肽受体（natriuretic peptide receptor B，NPR-B）和C型尿钠肽受体（natriuretic peptide receptor C，NPR-C），三者结构相似，都是由一个单一的跨膜结构域，将细胞外配体与细胞内激酶同源结构与催化域分开[11]。尿钠肽通过NPR-B促进cGMP的积累，NPR-C受体不与cGMP产生偶联，能够以高亲和力结合所有4种类型尿钠肽，反映其作为清除受体的主要功能[13]。Chen等[14]试验表明，NPR-B与CNP的亲和力大约是ANP的50倍，NPR-A基本不与CNP结合，故CNP的主要受体为NPR-B和NPR-C；NPR-B在结构和功能上与可溶性鸟苷酸环化酶（SGC）和腺苷酸环化酶相关，将细胞外信号转导到细胞内产生cGMP，继而通过其下游效应因子cGMP依赖性蛋白激酶（PKG）、磷酸二酯酶（PDE）和环核酸门控通道（CNG）参与多个生理过程的调节。在一定浓度范围内，cGMP对cAMP水解酶PDES具有调节作用，通过这种机制PDE可以作为cGMP介导的信号转导靶点，即cGMP在细胞中的一些调节作用可能通过影响cAMP途径而产生[15]。揭示NPR-B具有通过产生cGMP间接抑制cAMP降解的功能。

3 C型尿钠肽在动物繁殖调控中的作用

3.1 C型尿钠肽在雄性动物生殖活动的调控作用

CNP/NPR-B/cGMP级联导致睾丸中各种生物学效应，可能的旁分泌作用包括松弛生精小管，分别调节精子运输和睾丸血液供应进而调节睾丸的生精功能[16]。Nielsen等[17]研究表明，CNP主要表达于男性生殖腺即附睾、精囊腺和前列腺，这些器官的上皮细胞是精液CNP的主要来源；该研究还表明，人精浆中CNP浓度是血浆中的200多倍。研究表明，支持细胞是生精上皮中参与CNP/NPR-B/cGMP信号转导的主要细胞类型，CNP与附睾膜上的受体NPR-B结合，进而产生相当数量的cGMP，并通过CNG通道诱导Ca2+内流。Ca2+的升高也提高精子沿着化学引力梯度的游泳速度，从而增加精子活力[18-20]。将CNP-22注射到大鼠睾丸中，通过监测小分子探针在血生精小管屏障上的扩散来评估屏障功能，发现CNP可能通过影响间质细胞内cGMP水平来影响血生精小管屏障完整性，其作为成年大鼠睾丸血生精小管屏障动力学的调节因子进而调节血生精小管屏障在精子发生过程中的动态[21]。

CNP/NPR-B/cGMP级联反应不仅能调控睾丸细胞的自分泌和旁分泌功能，还对阴茎的勃起有重要的调节作用。CNP与阴茎海绵体膜的NPR-B受体结合，作用于颗粒细胞导致cGMP积累，通过调节其下游的PKG和环核苷酸门控通道调节正性肌力从而引起阴茎海绵体平滑肌细胞松弛[22]。CNP可引起对钙激活的K+通道、内向整流性K+通道和Na+-K+-ATP阻滞的强烈舒张作用[23]。

3.2 C型尿钠肽在雌性动物生殖中的调控作用

3.2.1 C型尿钠肽在雌性动物卵泡中的表达

在哺乳动物卵泡中，初级卵母细胞进入减数分裂，但滞留在第一次减数分裂中期的双线期，卵母细胞在这种休眠状态下持续数月至数年以等待卵母细胞胞质的成熟[5]。CNP在卵母细胞中的表达量受到卵母细胞发育周期的影响。Xi等[24]对卵泡发育过程中CNP和NPR-B的动态过程进行研究，发现在腔前卵泡发育的早期和晚期，NPPC和NPR-B的转录显著增加。进一步分离不同大小的小鼠卵泡并进行详细计数表明，CNP处理降低初级卵泡和早期次级卵泡的百分比，同时使晚期次级卵泡的百分比增加109%；在卵泡发育过程中检测到NPPC和NPR-B转录水平升高，并且在排卵前卵泡中达到最高水平[25]。Kawamura等[26]发现，在小鼠排卵前LH刺激引起NPPC转录迅速下降，在人类卵巢中进一步证实使用排卵剂量的LH后，卵泡液中的CNP表达水平下降。由此可以推测，CNP的表达量不断增加，通过维持高水平的cAMP使卵母细胞减数分裂停滞在双线期，在排卵前LH分泌量增加，对CNP的合成产生抑制作用，排卵前LH峰形成时CNP表达量达到最低，从而使减数分裂恢复，卵母细胞生发泡破裂。CNP在雌性动物卵母细胞的发生过程中作为一个成熟因子调节卵泡减数分裂，在Graafian卵泡中，NPPC基因表达于腔前卵泡和有腔卵泡的颗粒细胞，其受体NPR-B的表达定位于卵丘细胞， CNP通过激活卵丘细胞上的NPR-B刺激cGMP的产生，cGMP通过缝隙连接从卵丘细胞扩散至卵母细胞[24]。NPR-B受体还可以在卵母细胞膜上表达，不完全依赖于卵丘与卵母细胞之间的缝隙连接，定位于卵母细胞膜上的NPR-B在功能上响应CNP，在卵母细胞中不依赖缝隙连接内源性的产生cGMP[27]。卵母细胞源性生长因子（ODGFs）和雌二醇可以以旁分泌和自分泌的方式调节尿钠肽受体的表达，17-b雌二醇增加卵丘细胞对NPPC的敏感性并增加卵丘细胞中NPR-B的表达，与NPR-B促进cGMP的产生具有协同作用[28]。

3.2.2 C型尿钠肽在雌性动物生殖中的调控

CNP水平受多种因素的调控。LH/hCG刺激可抑制颗粒细胞中NPPC的表达，LH下调小鼠颗粒细胞CNP转录和卵泡液中的CNP蛋白的表达[26]。在人类中，LH诱导NPR-B鸟苷酸环化酶活性在20 min内下降[29]。这是因为编码NPPC的mRNA与LH受体在同一细胞中表达，LH受体会激活G蛋白和磷脂酶Cβ从而提高颗粒细胞中的Ca2+，而Ca2+升高和蛋白激酶C的激活都可以导致NPR-B的去磷酸化和失活，所以在同一细胞内暴露于LH可能标志着CNP数量的减少[30]。但卵丘细胞中表达的NPR-B受体不太可能受刺激排卵的LH的直接调节，因为卵母细胞源性旁分泌因子维持着卵丘细胞中NPR-B受体的表达，而LH在卵丘细胞和壁细胞上皮都缺乏受体从而必须涉及细胞间信号传递[25]。LH信号通路可以通过表皮生长因子（EGF）网络进行表达，LH会激活壁层颗粒细胞中的G蛋白偶联受体使卵母细胞中的cAMP增加形成cAMP峰，以负反馈调节形式抑制NPPC及NPR-B的表达从而激活EGF网络[31]。EGF调控网络中，EGF样因子（Areg）、表皮调节素（Ereg）和β细胞蛋白（BTC）作用于EGF受体，激活胞外信号调节蛋白激酶1和2、蛋白激酶C信号通路和颗粒细胞及卵丘细胞中的其他信号通路，以关闭缝隙连接的形式响应壁层颗粒细胞中LH的激增，从而下调NPR-B的表达[32]。促卵泡激素（FSH）也会影响CNP的转录和表达。目前对于FSH与CNP之间作用机制的研究尚不十分明确。有研究提出，FSH通过腔前卵泡刺激CNP的产生并且CNP反映FSH对腔前卵泡和小卵泡的生长刺激作用[11]。在腔前卵泡培养过程中，使用低剂量的FSH可以提高卵母细胞和卵丘细胞间的耦合效率，FSH诱导cAMP的产生并从周围的卵丘细胞流入。FSH和CNP具有一定程度的协同作用[24]。有研究表明，在体外，FSH刺激山羊颗粒细胞可以诱导NPR-C表达量的增加，并呈时间和剂量依赖性增长，NPR-C作为CNP的清除性受体可以降低CNP在卵母细胞中的浓度[33]。可以推断，在腔前卵泡阶段主要由CNP促进卵泡的发育和增长，FSH对CNP的产生具有促进作用，当卵泡发育到促性腺激素依赖期体内FSH分泌量增加，促进NPR-C清除性受体的表达从而降低CNP含量。已有研究表明，FSH在卵泡期控制卵母细胞生长及卵泡发育并诱导壁层颗粒细胞表达EGF受体，FSH信号与卵泡内EGF网络相交诱导EGF配体的积累引起级联反应关闭缝隙连接，减少NPR-B受体进入卵母细胞从而抑制CNP发挥作用[34]。推测低剂量的FSH促进CNP的产生，而高剂量的FSH在卵泡促性腺激素依赖期则通过影响EGF通路及NPR-C表达抑制CNP发挥作用。Michael等[35]使用多重RT-qPCR技术对原代小鼠内分泌组织以及广泛使用αT3-1和LβT2促性腺激素来源的细胞中尿钠肽相关基因的表达谱进行研究，CNP的靶细胞促性腺激素释放激素（GnRH）的分泌和CNP在促性腺激素细胞系中的信号转导相互拮抗，而且GnRH可以以钙和蛋白激酶C依赖的方式刺激近端的小鼠NPPC启动子，NPPC对脉动性GnRH的强烈反应证明GnRH是促性腺激素来源细胞中尿钠肽的调节器。

3.2.3 CNP在卵母细胞体外成熟中的应用

体外成熟培养（IVM）是将未成熟的生发泡（GV）阶段的卵母细胞经体外培养成熟的技术[36]。CAPA-IVM是一个完整的双相IVM系统，该系统最初是为小鼠的零刺激IVM开发，由一个卵母细胞获得即将发育能力的早熟阶段，和一个促进配体依赖的由卵丘细胞驱动的减数分裂成熟的IVM阶段组成[5]。第一阶段为IVM前阶段，阻滞自然减数分裂恢复，延长卵母细胞-卵丘细胞（CC）缝隙连接通讯（GJC），促进卵母细胞发育能力的获得；第二阶段为IVM阶段，诱导减数分裂的恢复和卵母细胞的成熟[29]。与传统IVM相比，CAPA-IVM体外成熟前系统中卵母细胞的“获能”即促进卵母细胞发育的能力至关重要，用CNP抑制减数分裂恢复被证明有较好的结果，因为其作为减数分裂停滞的自然决定因素既没有其他化学物质半衰期长和诱导细胞凋亡改变细胞结构的缺点，又保持了缝隙连接活性，并支持对卵母细胞发育至关重要的关键基因的表达[37]。已知CNP介导的体外成熟前培养系统关键作用机制为：防止或延缓体外自发的减数分裂恢复；保存卵丘卵母细胞缝隙连接通讯；支持卵母细胞周围的卵丘细胞的持续生长，调节卵丘细胞内的糖酵解和氧化代谢；提高卵母细胞内谷胱甘肽活性使卵母细胞不过多暴露于活性氧中，促进卵母细胞的成熟和发育；促进卵母细胞在减数分裂恢复前卵母细胞的有序停止,与获得减数分裂和发育能力相关的染色质从分散结构变为浓缩结构；减少不同大小闭锁状态的卵泡间的减数分裂异步性；在体外成熟前培养过程中，在卵丘细胞中发展具有功能的表皮生长因子信号网络[38]。Santiquet等[39]对小鼠卵丘细胞未扩张的COC进行培养，结果表明，体外成熟前系统导致的减数分裂停滞的2 h会显著增加卵母细胞中三磷酸腺苷（ATP）的产量，并显著影响线粒体膜电位的变化和卵丘细胞的扩展，这些都是影响卵母细胞质量及IVF后囊胚率的重要因素。

4 结论

CNP与动物生殖系统功能关系密切，其具体作用机制是通过产生cGMP间接影响生殖细胞内cAMP的含量，从而影响生殖活动。CNP主要通过旁分泌的方式影响雄性动物的生精作用及精子活力。CNP在雌性动物中的表达，随发情周期的变化而变化，受多种内分泌激素及通路的影响。在许多双向体外成熟系统的研究中，添加CNP作为卵母细胞减数分裂抑制剂的前培养系统显著提高卵母细胞成熟率及体外受精后的囊胚率。目前针对CNP对体外受精和妊娠结局的影响尚停留在初级阶段，具体机制有待进一步研究。