离子液体分散液液微萃取-高效液相色谱分析苹果中有机磷农药残留

彭帆，谭雨嫣，张珊珊，余小芳，陈怀侠

(湖北大学化学化工学院，湖北 武汉 430062)

0 引言

有机磷农药(organophosphorus pesticides，OPPs)品种多且药效高，在农业生产中被广泛用来控制害虫和保护农业产品.OPPs多为磷酸酯类或硫代磷酸酯类，进入体内会与胆碱酯酶结合使其失去水解乙酰胆碱的能力，从而引起生理功能紊乱，也可诱发其他疾病而严重影响人类的健康.因为有机磷农药价格相对较低，控制害虫、杂草的效能高，在农业生产中存在着违法大量使用OPPs杀虫剂的现象[1-4].因此，建立快速简便、灵敏可靠检测食品中OPPs残留的分析方法十分重要.

目前，测定食品基质中OPPs农药残留的方法主要有气相色谱法(GC)、高效液相色谱(HPLC)、气相色谱-质谱联用(GC-MS)和液相色谱-串联质谱联用(LC-MS)[5].其中，GC对沸点高、热稳定性差和极性强的有机磷农药分析有一定的局限性，GC-MS和LC-MS仪器昂贵，测试成本较高，不易普及.HPLC操作简便，对分析物的沸点、热稳定性和极性没有限制，应用广泛.食品和果蔬样品组成复杂、农药残留含量低，样品前处理可以有效改善HPLC灵敏度和选择性[4].

液液萃取(LLE)、固相萃取(SPE)、搅拌棒吸附萃取(SBSE)和固相微萃取(SPME)[6-7]都曾用于从不同基质中分离富集OPPs.然而，液液萃取需要大量的有毒溶剂，固相萃取选择性有限，固相微萃取的萃取纤维昂贵而易碎，限制了其使用寿命.液相微萃取(LPME)被看作是溶剂最小化的样品前处理方法，不需要昂贵的设备，操作简便快速，而且很少接触有毒溶剂，但液滴稳定性差、精密度和灵敏度相对较低[8].分散液液微萃取(dispersive liquid-liquid microextraction，DLLME)是一种新型液液微萃取方法[9]，即将萃取剂完全分散在样品溶液中以扩大萃取剂和溶液的接触面积，可以在很短的时间内达到萃取平衡.因而，该方法回收率和富集倍数高、操作简单、萃取速度快，被广泛关注[10].DLLME常用卤代烃为萃取溶剂，毒性较大.因此，寻找毒性较低的新型萃取溶剂是DLLME研究的方向.离子液体(ionic liquids，ILs)是指在室温或接近室温下呈现液态的、完全由阴阳离子所组成的盐.常见的阳离子有咪唑盐离子、季铵盐离子和吡咯盐离子等阴离子部分主要以卤素离子和其他无机酸离子为主.离子液体具有独特的理化性质，热稳定性好、溶解能力强、环境友好，被称为绿色溶剂.将室温离子液体作提取剂应用到分散液液微萃取中，避免使用高毒溶剂，也扩大了分散液液微萃取法的应用范围.目前，IL-DLLME已应用于不同样品中农药残留的分离富集，如水、茶叶、土壤、水果等[4,11-16].

本研究以咪唑类离子液体[C6MIM][PF6]为萃取剂，对苹果中哒嗪硫磷、对硫磷、倍硫磷和伏杀硫磷进行DLLME，在优化的萃取条件下，建立了苹果中4种有机磷农药多组分同时定量分析的IL-DLLME-HPLC方法，进行了方法的考察并应用于苹果样品中4种有机磷农药(哒嗪硫磷、对硫磷、倍硫磷和伏杀硫磷)的测定，结果满意.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂Dionex Summit 680 HPLC仪(美国Dionex公司)并配有Chromeleon色谱管理软件及紫外检测器(UV-170)，手动进样器(大连依利特公司)配5 μL定量环；柱温箱(LGC-1025M，荆州市楚新电子产品开发有限公司)；80-2型离心机(江苏电子仪器公司)；WH-3微型旋涡混合仪(上海沪西分析仪器厂)；RE-52AA旋转蒸发仪(上海雅荣生化设备仪器有限公司)；DL-01溶剂过滤器(DL01真空泵+FB01T过滤瓶，天津市东康科技有限公司)；Aquaplus超纯水制水仪(AWJ1-0501-U，艾科浦公司)；pHS-25型酸度计(上海伟业仪器厂)；十万分之一电子分析天平(北京赛多利斯天平有限公司)；B-200超声波清洗器(美国Branson公司)；0.22 μm和0.45 μm滤膜和微孔过滤器(上海兴亚净化材料厂)；可调式移液器(10～50 μL和50～100 μL，上海求精生化试剂仪器有限公司；Finnpipette100-1 000 μL，上海热电仪器有限公司).

哒嗪硫磷(pyridaphenthion，99.0%)、对硫磷(parathion，99.5%)、倍硫磷(fenthion，99.2%)和伏杀硫磷(phosalone，99.0%)购于美国Dima科技公司，离子液体([C4MIM][PF6]和[C6MIM][PF6]，99.0%)购于上海成捷化学有限公司，色谱纯甲醇和乙腈(Tedia公司，美国)，水(超纯水)，分析纯丙酮、氯化钠、无水硫酸镁、磷酸等.

标准溶液的配制：以甲醇为溶剂配制浓度为3 mg/mL的哒嗪硫磷、对硫磷、倍硫磷和伏杀硫磷标准储备液.以超纯水适当稀释储备液配制浓度为50 ng/mL的标准溶液.所有溶液均在4 ℃条件下避光保存.

1.2 色谱条件色谱柱：Varian Pursuit-C18色谱柱(5 μm，4.6 mm×250 mm，Varian Technologies，PaloAlto，CA，美国)，配有相同填料的预柱(2.1 mm×12.5 mm，5 μm，Agilent Technologies，PaloAlto，CA，美国)，流动相：甲醇-水(80∶20，V/V)，流速：1.0 mL/min，柱温：25 ℃，进样量：5 μL，检测波长：251 nm和284 nm.

1.3 样品的处理新鲜苹果样品购于当地超市，用食品粉碎机粉碎.称取5.0 g样品于20 mL离心管中，加入10 mL乙腈，充分振荡1 min，加入2.0 g无水硫酸镁和1.0 g氯化钠，漩涡振荡，在4 000 r/min条件下离心10 min，取上清液过0.45 μm微孔滤膜，滤液在40 ℃条件下用旋转蒸发仪蒸发近干，残渣用10 mL超纯水超声溶解后用0.22 μm的微孔滤膜过滤，滤液用于IL-DLLME.

1.4 IL-DLLME过程取5.0 mL样品溶液置于10 mL离心管中，用1 mL注射器将包含0.7 mL甲醇和60 μL[C6MIM][PF6]的混合液喷射到样品溶液中，轻轻摇动离心管，以4 000 r/min转速离心8 min，除去上层水相，用50 μL甲醇稀释沉淀相，稀释液用于HPLC分析.

1.5 工作曲线的制作在空白苹果样中分别添加浓度为20、100、500、1 000、1 500、2 000 μg/kg的4种有机磷，按样品处理方法制备样品溶液.用于DLLME-HPLC分析，获得浓度和峰面积之间的线性关系.

2 结果与讨论

优化DLLME条件时，以回收率(extraction recovery，ER)评价萃取效率.

式中C0为样品溶液浓度，Csed为沉淀相浓度，Vaq为样品溶液体积，Vsed为沉淀相体积.

2.1 萃取条件优化

2.1.1 萃取剂的选择 合适的萃取溶剂是保证IL-DLLME萃取效率的前提.咪唑类离子液体常被用作萃取溶剂，本实验选用两种咪唑类离子液体[C4MIM][PF6]和[C6MIM][PF6]为萃取剂.取用0.7 mL甲醇分别和60 μL离子液体混合进行萃取，结果发现，萃取后[C6MIM][PF6]和水相有效分离，而[C4MIM][PF6]无法分离，这可能是因为[C4MIM][PF6]水中溶解度(18.8 g/L)远大于[C6MIM][PF6](7.5 g/L)，60 μL的[C4MIM][PF6]完全溶于水中.后续实验选用[C6MIM][PF6]为萃取剂.

2.1.2 分散剂的选择 分散剂在萃取剂和水中的混溶性是选择分散剂的依据.本实验分别以0.7 mL甲醇、乙腈、丙酮为分散剂，60 μL[C6MIM][PF6]为萃取剂混合进行萃取.结果发现，甲醇为分散剂时的回收率比乙腈好(如图1)，而丙酮自身有很强的紫外吸收，对目标物分析有干扰.故选择甲醇为分散剂.

图1 分散剂种类对回收率ER的影响

2.1.3 离子液体体积的影响 固定甲醇体积为0.7 mL，考察离子液体为30～80 μL时的回收率.结果表明，随着离子液体体积的增加，沉淀相的体积也在增加.当体积为30 μL时，无沉淀相产生.如图2(a)所示，从40 μL到80 μL变化时，萃取回收率先增加后降低，在体积为60 μL时回收率最高，故后续实验离子液体体积选择60 μL.

2.1.4 分散剂体积的影响 分散剂体积的改变会改变沉淀相的体积，因而影响回收率.本实验考察甲醇体积在0.4～1.0 mL范围内的影响.随着甲醇体积的增加，沉淀相体积减少，回收率的变化是先升高再降低，如图2(b)所示.0.7 mL甲醇具有最好的回收率，故选择0.7 mL甲醇为分散剂.

2.1.5 萃取温度的影响 萃取温度不同也会影响回收率，为此，本实验考察了3～40 ℃萃取温度对萃取效率的影响.结果发现，随着温度升高，所得的沉淀相变少，回收率的变化同时由沉淀相体积和萃取后目标物浓度决定，如图2(c)所示，在20 ℃时的回收率最高，故后续实验在室温条件下进行萃取.

图2 离子液体体积(a)，分散剂体积(b)，萃取温度(c)，盐浓度(d)，溶液酸度(e)，离心时间(f)，样品体积(g)对ER的影响

2.1.6 离子强度的影响 在样品溶液中加入不同量的NaCl(0～20%,W/V)，考察离子强度对回收率的影响.结果如图 2(d)所示，随着NaCl加入量的增加，回收率逐渐减小.故后续实验不加NaCl.

2.1.7 溶液酸度的影响 溶液酸度的变化可能会改变分析物的存在形式，从而影响回收率.4种有机磷农药在碱性溶液中会迅速分解，故本实验以H3PO4调节溶液pH为2.0～7.0，考察酸度对回收率的影响.结果如图 2(e)所示，该酸度范围内，萃取效率基本不变.故本实验不改变溶液的酸度.

2.1.8 萃取时间和离心时间的影响 在DLLME中，萃取时间是指混合萃取剂喷射后到离心开始的时间.实验发现，在0～10 min范围内，萃取效果没有明显变化.这是因为萃取剂瞬间被雾化为极小液滴，有理想的表面积，所以萃取效率高.即分散液液微萃取快速，瞬间完成.

本实验中考察离心时间为2～15 min时回收率的变化.如图2(f)所示，离心8 min时，回收率最高，这可能是因为短时间的离心不能使离子液体沉淀完全，而离心时间太长会产生热效应，增大离子液体在水中的溶解度，降低目标物的回收率.故最终选择离心8 min.

2.1.9 样品体积的影响 样品体积会影响回收率，为此选择了2.0、3.0、5.0、6.0和8.0 mL的样品溶液进行萃取.前面优化的萃取剂和分散剂比例为6∶70，改变样品体积时，同时也要相应改变萃取剂和分散剂的量，比例不变.分别用0.3、0.45、0.7、0.9和1.2 mL混合萃取剂(萃取剂与分散剂以6∶70混合)进行萃取时，随着样品体积的增加，沉淀相体积也增加，萃取回收率也相应发生了变化，如图2(g)所示，当样品体积为5.0 mL时回收率最高，因此后续实验使用5.0 mL样品溶液.

2.2 方法的评价在优化的实验条件下，对添加标样的苹果样品进行分析，如表1所示，4种有机磷在20～2 000 μg/kg浓度范围内线性关系良好，相关系数在0.995 5～0.999 3范围内，检测限(LOD，S/N=3)为5.7～8.4 μg/kg，低于我国食品中农药最大残留限量(哒嗪硫磷0.3 mg/kg、对硫磷0.01 mg/kg、倍硫磷0.05 mg/kg和伏杀硫磷2 mg/kg).以添加标样100 μg/kg的苹果样品进行精密度考察，日内精密度RSD(n=5)为5.4%～8.4%，日间精密度RSD(n=5)为6.1%～10.6%.富集倍数为246～273.图3是空白苹果样品DLLME、空白苹果加标前后DLLME的HPLC图.可见，IL-DLLME对4种有机磷具有良好的分离富集效果，可以有效提高HPLC分析的灵敏度.

图3 空白苹果样品DLLME(1)、空白苹果样品加标100 μg/kg(2)、加标100 μg/kg苹果样品DLLME(3)HPLC图

表1 方法的线性范围、精密度和检测限

2.3 实际样品分析分别对购于超市的3种苹果样品进行分析，均没有检出4种有机磷.为考察本方法对于实际样品的应用性，向苹果样中分别加入高、中、低3种浓度的4种有机磷，然后萃取分离分析.如表2所示，4种有机磷的平均加标回收率为85.3%～101.1%，日内精密度RSD为2.1%～12.6%，日间精密度RSD为4.2%～15.0%(n=5).可见，本方法回收率高、精密度好，适合于实际苹果样中有机磷农药的分析.

表2 高、中、低3种浓度的加标回收率和精密度

2.4 方法比较将本方法与其他方法相比较，如表3所示.可见，本方法萃取快速、线性范围宽，特别是本方法的检测限与GC-MS的相当，并且离子液体挥发性弱，环境友好.

表3 IL-DLLME方法与其他方法的比较(苹果样品)

3 结论

以离子液体[C6MIM][PF6]为萃取溶剂进行样品溶液的分散液液微萃取，环境友好，萃取效率高，可以实现对水果中有机磷农药残留的有效分离富集，结合HPLC，建立了苹果样品中4种有机磷农药残留的分离分析方法.该方法操作简单、快速、污染小、灵敏度高、精密度好，适合用于苹果样品中有机磷农药的分离分析.