消瘿方对甲状腺FRTL细胞增殖与凋亡的影响

(上海市金山区亭林医院普外科,上海 201505)

甲状腺结节是最常见的内分泌疾病之一，发病率高达6%～7%，以良性结节多见[1-2]。已有研究显示，甲状腺结节的发生是遗传、免疫紊乱、激素失调等多种原因共同触发而导致甲状腺结构及功能异常，其中甲状腺细胞的增殖与凋亡平衡破坏在疾病的发生过程中起重要作用[3-4]。西医治疗甲状腺结节常出现结节复发、骨质疏松、甲状腺功能下降等副作用[5-6]，而中医药具有毒小效优、多环节、多途径治疗特点，在防治甲状腺结节、改善症状、调节机体免疫等方面优势明显[7]。消瘿方以“益气养阴、祛痰散结”为治则，为中药治疗“瘿病”代表性方剂，临床常用该方加减治疗甲状腺疾病。本研究旨在探讨消瘿方对甲状腺FRTL细胞增殖与凋亡的影响，为中医药治疗甲状腺结节提供基础理论支撑。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1实验动物 SPF级4周龄SD大鼠15只，雌雄不拘，体质量200～220 g，由上海斯莱克动物有限公司提供。

1.1.2药物 消瘿方组方：黄芪30 g，玄参15 g，党参15 g，白芍15 g，北沙参15 g，制香附15 g，浙贝母15 g，夏枯草10 g，当归10 g，柴胡10 g，海浮石10 g，白芥子6 g，原药材均购自上海群力中草药店。全方加8倍体积水煎煮2次，并浓缩至人临床等效剂量的0.5、1.0、2.0倍剂量。左甲状腺素钠片购自默克雪兰诺有限公司，规格每粒50 μg。

1.1.3主要试剂与仪器 大鼠甲状腺FRTL细胞株(武汉普诺赛)；DMEM培养基(美国Gibco)；bax、bcl-2、caspase-3多克隆抗体(英国Abcam)；GAPDH单克隆抗体(美国CST)；HRP-IgG二抗(武汉博士德)；MTT粉末、Hoechst 33258染液(上海碧云天)；RIPA、Trizol(北京中杉金桥)；CO2培养箱、酶标仪(美国Thermo)；超微量核酸蛋白测定仪(英国BioDrop)；凝胶成像分析系统、实时荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad)。

1.2 实验方法

1.2.1含药血清的制备SD大鼠随机分为空白组、低浓度消瘿方组、中浓度消瘿方组、高浓度消瘿方组和阳性药组，每组3只。低、中、高浓度消瘿方组分别给予7.47、14.94、29.88 g/kg的中药复方煎液(相当于临床等效剂量的0.5、1.0、2.0倍)，阳性药组给予0.18 mg/kg(临床等效剂量)左甲状腺素钠片水溶液，空白组则给予等量蒸馏水。各组均于每天上、下午固定时间灌胃给药1次，连续灌胃5 d。第6天上午灌胃完成后1 h麻醉大鼠，腹主动脉取血，室温静置2 h，以3 000 r/min离心10 min，分离血清，56 ℃水浴灭活30 min，分装、保存备用，使用前用0.22 μm微孔滤膜过滤。

1.2.2细胞培养 取大鼠甲状腺FRTL细胞株，用含体积分数0.10胎牛血清的DMEM培养基，于37 ℃、含体积分数0.05 CO2饱和湿度下培养，待细胞基本长满培养瓶底部(2～3 d)时消化传代，取对数生长期细胞，随机分为5组。 空白对照组(A组)：加入空白组血清；低浓度消瘿方组(B组)：加入低浓度消瘿方组含药血清；中浓度消瘿方组(C组)：加入中浓度消瘿方组含药血清；高浓度消瘿方组(D组)：加入高浓度消瘿方组含药血清；左甲状腺素钠组(E组)：加入阳性药组含药血清。

1.3 检测指标及方法

1.3.1MTT法检测细胞增殖率 采用胰蛋白酶消化并调整细胞密度，以每孔5 000个细胞接种于96孔板中，待细胞完全贴壁后，弃去培养液，各组分别加入对应的含药或者正常血清。每组设6个复孔，同时设置空白孔。分别于培养箱中培养24、48 h，加入MTT液避光孵育4 h，然后加入DMSO液，室温下振荡10 min，酶标仪测定450 nm波长处各孔的吸光度(A)值，计算细胞增殖率。增殖率(%)=(A含药血清-A空白孔)/(A空白血清-A空白孔)×100%。

1.3.2Hoechst染色法检测细胞凋亡情况 调整细胞密度，加入含药或者正常血清后继续培养24 h。取出96孔板，弃去培养液，加入PBS液洗涤3次，然后每孔加入Hoechst 33258染液100 μL，37 ℃避光孵育30 min；孵育完成后，弃去孔内染液，PBS液洗涤3次后，倒置荧光显微镜下观察各组细胞的凋亡形态。

1.3.3Western blotting法检测凋亡相关蛋白表达收集含药或者正常血清培养24 h后的细胞，加入裂解液冰上裂解20 min，以4 ℃、12 000 r/min离心10 min后取上清液，应用超微量核酸蛋白测定仪测定细胞总蛋白含量。制备分离胶和浓缩胶，蛋白上样、电泳、转膜、脱脂奶粉封闭后，加入稀释后的一抗(1∶1 000稀释)，4 ℃孵育过夜。洗涤条带，加入二抗(1∶500稀释)室温下孵育4 h，洗涤，化学发光法显影。用Image-Pro Plus软件分析各条带的灰度值，以GAPDH为内参照，计算目的蛋白Bax、Bcl-2和Caspase-3的相对表达水平。

1.3.4RT-PCR法检测凋亡相关基因表达 收集含药或者正常血清培养24 h细胞于EP管内，加入1 mL Trizol试剂提取细胞总RNA，检测含量合格后逆转录合成cDNA(按反转录试剂盒要求操作)，采用PCR扩增目的基因产物，以β-actin基因为内参照。引物由深圳华大基因公司合成，序列见表1。用2-△△CT法对细胞目的基因bax、bcl-2、caspase-3水平进行定量分析。

以上指标检测各组均用3份血清进行3次独立重复实验。

表1 基因引物及其序列

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 各组FRTL细胞增殖率比较

析因设计资料的多因素方差分析显示，不同处理方式对FRTL细胞增殖率影响差异有显著意义(F=12.40，P<0.01)，而相同处理方式不同时间处理对FRTL细胞增殖率没有显著影响(P>0.05)，且处理方式和处理时间无交互效应(P>0.05)。与空白对照组比较，高浓度消瘿方含药血清培养能显著降低FRTL细胞的增殖率(F=6.71、5.85，P<0.05)。与阳性药左甲状腺素钠组比较，高浓度消瘿方含药血清培养后FRTL细胞增殖率差异无显著性(P>0.05)。见表2。

表2 各组FRTL细胞增殖率比较

2.2 各组FRTL细胞凋亡形态观察

空白对照组FRTL细胞密集、分布均匀，细胞形态正常，荧光呈暗蓝色，无明显的凋亡特征；中、低浓度消瘿方组FRTL细胞数量稍有减少，但细胞形态、密度及荧光颜色与空白对照组比较差异不明显；高浓度消瘿方组及左甲状腺素钠组FRTL细胞数目明显减少，排列散乱无规则，部分细胞核碎裂，细胞透亮，荧光颜色明显，呈现典型的凋亡形态学特征。见图1。

A：空白对照组；B：低浓度消瘿方组；C：中浓度消瘿方组；D：高浓度消瘿方组；E：左甲状腺素钠组。Hoechst染色，200倍。

2.3 各组FRTL细胞凋亡相关蛋白表达比较

与空白对照组比较，中、高浓度消瘿方含药血清培养能显著增加FRTL细胞促凋亡因子Bax蛋白的表达(F=9.97,P<0.01)，降低抗凋亡因子Bcl-2蛋白的表达(F=14.73,P<0.01)，升高Bax/Bcl-2比值(F=63.20,P<0.01)，上调凋亡执行蛋白Caspase-3的表达(F=53.82,P<0.01)。与左甲状腺素钠组相比较，高浓度消瘿方含药血清培养后FRTL细胞凋亡相关蛋白表达差异无显著性(P>0.05)，而中浓度消瘿方含药血清培养后Bax/Bcl-2比值和凋亡执行蛋白Caspase-3表达降低(P<0.01)。与中浓度消瘿方组比较，高浓度消瘿方组Bax/Bcl-2比值和凋亡执行蛋白Caspase-3的表达增高(P<0.01)。见图2和表3。

A：空白对照组；B：低浓度消瘿方组；C：中浓度消瘿方组；D：高浓度消瘿方组；E：左甲状腺素钠组。

表3 各组FRTL细胞凋亡相关蛋白表达比较

2.4 各组FRTL细胞凋亡相关基因表达比较

与空白对照组比较，中、高浓度消瘿方含药血清培养能显著增加FRTL细胞促凋亡因子Bax基因表达(F=15.52,P<0.01)，降低抗凋亡因子bcl-2基因的表达(F=12.83,P<0.01)，升高基因bax/bcl-2比值(F=45.89,P<0.01)，上调凋亡执行蛋白caspase-3基因的表达(F=21.91,P<0.01)。与左甲状腺素钠组比较，高浓度消瘿方含药血清培养后FRTL细胞凋亡相关基因表达差异无显著意义(P>0.05)，而中浓度消瘿方含药血清培养后FRTL细胞基因bax/bcl-2比值降低(P<0.01)。与中浓度消瘿方组相比较，高浓度消瘿方含药血清培养后FRTL细胞基因bax/bcl-2比值显著增高，差异有显著性(P<0.01)。见表4。

表4 各组FRTL细胞凋亡相关基因表达比较

3 讨 论

甲状腺结节属中医“瘿病”范畴，病始在肝，肝气郁滞而化火，灼伤津液而生痰，痰浊内阻，瘀阻脉络，以致气机逆乱，气血通行不畅，集结于颈部，导致此病发生[8]。其中医病机关键是脏腑功能紊乱，气血阴虚失和，气滞、痰凝等有形之邪蕴结于局部而成瘿肿，治当以“益气养阴、祛痰散结”为法。

消瘿方由黄芪、玄参、党参、白芍、北沙参、制香附、浙贝母、夏枯草、柴胡、当归、海浮石、白芥子等药组成。方中以黄芪为君药，益气固表，消肿生肌，并能调节机体免疫及激素平衡；玄参、党参、白芍、北沙参为臣药，助黄芪益气消肿之功效；制香附、浙贝母、夏枯草、柴胡、当归、海浮石及白芥子为佐使药，以行气活血、消肿散瘀、养阴化痰、软坚散结。诸药合用，共奏益气养阴、祛痰散结兼扶正之功。临床研究证实，消瘿方治疗甲状腺结节、桥本甲状腺炎等甲状腺疾病疗效显著[9-11]。

甲状腺细胞的正常增殖与凋亡是维持甲状腺功能的基础，细胞增殖速度过快以及细胞凋亡功能降低均参与了甲状腺结节的形成过程[12]。恢复甲状腺细胞增殖与凋亡的平衡，是治疗该疾病的重要策略[13-14]。本实验采用MTT法观察消瘿方对甲状腺FRTL细胞增殖的影响，结果显示，高浓度消瘿方刺激的含药血清能有效抑制FRTL细胞增殖；但其抑制FRTL细胞增殖效果不呈时间依赖性，因此后续研究中将干预时间设定为24 h。本文应用Hoechst 33258荧光染色法观察细胞凋亡形态，结果显示，高浓度的消瘿方含药血清能导致FRTL细胞数量下降，分布散乱，细胞核碎裂、固缩、透亮，呈现明显的凋亡特征。

Bcl-2家族是目前公认与凋亡密切相关的基因，包括bax、bad等促凋亡因子和bcl-2、bcl-xl等抗凋亡因子基因，其中bax和bcl-2的相对表达水平高低直接决定细胞对凋亡刺激的反应程度[15-16]。抗凋亡因子bcl-2主要是通过抗氧化或抑制氧自由基产生来阻止细胞凋亡，促凋亡因子bax则是通过线粒体途径形成同源二聚体而诱导细胞凋亡，bax/bcl-2间的平衡决定细胞凋亡是否发生[17-20]。研究显示，在甲状腺结节疾病状态下，抗凋亡的bcl-2表达增加而促凋亡的bax下降，导致bax/bcl-2比值异常，凋亡相对不足[21-23]。

Caspase家族是一组存在于细胞质中具有特定结构的蛋白酶，该家族相关蛋白的激活能诱发细胞凋亡，而Caspase家族成员的活性受到Bcl-2家族系列因子的调控[16,24]。其中，Caspase-3是Caspase家族中最关键的成员之一，是细胞凋亡过程中最关键的执行者[26]。本文研究结果显示，消瘿方含药血清能有效增加促凋亡因子bax表达而降低抗凋亡因子bcl-2表达，打破促/抗凋亡因子bax/bcl-2间的平衡，同时上调caspase-3表达，从而诱导甲状腺FRTL细胞凋亡。

综上所述，以“益气养阴、祛痰散结”为治则的消瘿方能抑制甲状腺FRTL细胞增殖，促进其凋亡，其机制可能与破坏促/抗凋亡因子bax/bcl-2间平衡、上调caspase-3表达有关。本研究从细胞层面明确了消瘿方对甲状腺疾病的治疗作用，为该方的临床应用提供了实验依据。下一步拟对该方进行拆解，筛选并明确其发挥疗效的有效成分。