加味芪黄饮对糖尿病肾病大鼠肾纤维化的影响

周艳利，蒙向欣，李辉远，何 骋

（1．广州医科大学附属中医医院，广东 广州 510130；2．广东省广州市东升医院，广东 广州 510130）

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病较重要的微血管并发症之一，也是导致终末期肾病的首要原因。近年来，DN发病率越来越高，且治疗费用较高，社会的经济负担重［1］。肾纤维化是各种慢性肾病进展到终末期肾衰竭的共同通路，也是DN引起肾功能衰竭的主要途径［2］。DN的形态学改变如细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的过度增生、沉积及肾小球基底膜（glomerular basement membrane，GBM）的增厚等与肾功能降低密切相关。Ⅲ型胶原（Collagen type III，Col-Ⅲ）及Ⅳ型胶原（Collagen type IV，Col-Ⅳ）均属胶原蛋白，是构成ECM的主要成分［3］。血清中IV、Ⅲ型胶原增高在一定程度上反映体内纤维化情况，被称为肾纤维化指标［4］。本研究拟通过观察加味芪黄饮对DN大鼠的治疗作用，研究其对Col-Ⅲ、Col-Ⅳ的表达的影响，以期为加味芪黄饮治疗DN提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物

3月龄SD大鼠（南方医科大学实验动物中心，许可证号：SYXK（粤）2018-0001）60只，雄性，SPF级，体质量（300±25）g。

1.2 药物及试剂

加味芪黄饮由广州市中医医院中药制剂室提供。药用黄芪30g，太子参、生地、山药、白茅根各20g，泽泻、茯苓、蝉蜕、溪黄草、女贞子各15g、山茱萸、丹皮各10g。加水500mL，用我院传统容器煎药机浓煎45min，用无菌保鲜的真空包装，1袋150mL，放置冰箱保存，使用时加热至30℃胃饲。链脲佐菌素（streptozotocin，STZ，美国Sigma公司生成，批号S0130），碘125胰岛素放射免疫分析试剂盒（北京科美东雅公司），HRP标记的羊抗兔IgG（美国CST公司，批号CST #5127）。

1.3 仪器

RM2135型石蜡切片机（德国LEICA公司）；IX71型普通荧光倒置显微镜（日本OLYMPUS公司）；全自动生化分析仪（日本日立公司）；HL-10型循环式无压力传统容器煎药机（韩国和印物业）。

1.4 T2DM肾病大鼠模型复制

SD大鼠适应性喂养1周后，随机分为正常对照组（15例）和T2DM肾病组（45例）。正常对照组大鼠予普通饲料喂养。T2DM肾病组：大鼠予高糖高脂饮食（66.5%常规饲料+20%蔗糖+10%猪油+2.5%胆固醇+1%胆酸盐），喂养8周后，禁食24h，空腹状态下取1%STZ按45mg/kg一次性腹腔注射。1周后，内眦静脉取血测定大鼠空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）水平，当FBG＞7.8mmol/L，表明T2DM模型建立成功。STZ注射后2周，用代谢笼收集两组大鼠24h尿液，检测24h尿白蛋白（24h urine albumin，24h UAlb）水平，当24h UAlb＞正常对照组均值3倍时，表明T2DM肾病模型制备成功，结果制备成功的大鼠模型共有39只。

1.5 分组及给药方法

进一步将T2DM肾病大鼠随机分为模型对照组、加味芪黄饮低剂量组和高剂量组（以下简称低剂量组、高剂量组），每组各13只。低、高剂量组大鼠每日分别予加味芪黄饮400mg/kg、800 mg/kg，正常对照组、模型对照组大鼠则分别予等量生理盐水。均灌胃给药12周。

1.6 血及尿生化指标检测

给药结束后用代谢笼收集各组大鼠24h尿液行24h UAlb定量，收集大鼠内眦静脉血测定血肌酐（Serum creatinine，Scr）、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）水平。

1.7 肾组织HE染色检查

给药结束后检杀各组大鼠，取一侧肾脏置于10%福尔马林固定后，石蜡包埋备用。用切片机将肾组织制成厚度2μm切片，常规脱蜡后，进行HE染色，光镜下观察各组大鼠肾组织病理变化。

1.8 采用免疫组织化学二步法

检测残肾组织中Col-Ⅲ及Col-Ⅳ的表达。光镜下观察，阳性染色细胞胞浆或胞膜出现黄色或棕黄色颗粒，胞核呈蓝色。采用IPP6.0医学图像分析系统，每张切片随机选取5个不含肾小球和小血管的肾皮质400倍视野，测定累积光密度（IOD）值，对Col-Ⅲ及Col-Ⅳ进行图像分析。

1.9 统计学方法

采用SPSS16.0统计软件进行数据分析，数据以（±s）表示。组内分析采用成组t检验方法。多组间比较采用单因素方差分析，方差齐时，用方差分析-LSD法，方差不齐时，用校正方差分析法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠24 h UAlb、Scr、BUN、FBG测定

测定各组大鼠血、尿生化指标。与正常对照组相比，模型对照组大鼠24h UAlb、Scr、BUN、FBG水平均明显升高（P＜0.05）；与模型对照组比较，加味芪黄饮高、低剂量组大鼠24h UAlb、Scr、BUN、FBG、水平均更低（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠24 h UAlb、Scr、BUN、FBG测定 （±s ）

表1 各组大鼠24 h UAlb、Scr、BUN、FBG测定 （±s ）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与模型对照组比较，#P＜0.05；与低剂量示组比较，▲P＜0.05。

组别 鼠数 24 h UAlb/（mg·24 h） Scr/（mmol·L） BUN/（mmol·L） FBG/（mmol·L）正常对照组 15 9.27±2.63 62.31±3.45 6.78±1.54 6.05±0.68模型对照组 13 107.53±11.67* 105.74±7.89* 28.33±3.78* 21.15±1.55*低剂量组 13 84.89±10.54# 90.45±5.67# 23.67±3.37# 17.34±1.98#高剂量组 13 61.67±8.21#▲ 78.74±4.65#▲ 20.11±3.67#▲ 13.43±1.50#▲

2.2 各组大鼠肾组织病理变化

光镜下观察各组大鼠肾组织病理改变。正常对照组：肾小球体积正常，系膜细胞、系膜基质未见增生，基底膜无增厚，肾小管形态结构正常。模型对照组：肾小球肥大，肾小球囊腔呈裂隙状，系膜细胞、系膜基质弥漫增生，毛细血管袢塌陷或闭塞，肾小管管腔狭窄。加味芪黄饮高、低剂量组与模型对照组比较，病理损伤减轻，且随药物剂量增大，其损伤恢复程度更趋明显。

2.3 各组大鼠肾组织胶原蛋白表达变化

Ⅲ型胶原正常仅在于肾间质及肾小管上皮细胞轻度表达，阳性染色为棕黄色。实验中可见模型组大鼠肾小管间质可见大量Ⅲ型胶原沉积，小片状分布，着色深，与正常组相比Col-Ⅲ、Col-Ⅳ表达显著增多，差异有统计学意义（P＜0.01）。加味芪黄饮低剂量组与高剂量组均较模型组表达减少，且差异有统计学意义（P＜0.01）。加味芪黄饮高剂量组与低剂量组比较表达减少，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表2。表明加味芪黄饮可显著降低肾组织中Col-Ⅲ、Col-Ⅳ的表达，提示加味芪黄饮可能通过减少细胞外基质的沉积，延缓肾纤维化，且与剂量呈正相关。

表2 Col-Ⅲ、Col-Ⅳ平均光密度的定量分析 （±s ）

表2 Col-Ⅲ、Col-Ⅳ平均光密度的定量分析 （±s ）

注：与正常组比较，◆P＜0.05；与模型组比较，★P＜0.05；与低剂量组比较，▲P＜0.05。

组别 鼠数 Col-Ⅲ平均光密度 Col-Ⅳ平均光密度正常对照组 15 0.3128±0.0016▲ 0.2923±0.0065▲模型对照组 13 0.4002±0.0014◆ 0.3807±0.0016◆低剂量组 13 0.3675±0.0007◆★ 0.3487±0.0015◆★高剂量组 13 0.3302±0.0006◆★▲ 0.3113±0.0007◆★▲

3 讨 论

DN早期病理特征为肾小球肥大和GBM增厚以及ECM合成增多，逐步出现肾小球纤维化，最终引起肾功能衰竭［5-6］。肾间质纤维化的病理生理过程主要包括：细胞激活与损伤、形成纤维化的信号传递、纤维化形成以及肾脏损害等。过度沉积的纤维组织，包括间质胶原（I型、Ⅲ型、Ⅳ型）、纤维连接素和一些糖蛋白取代了健康的肾单位，导致肾脏原有组织结构的改变，损伤了肾功能，从而导致有效肾单位逐渐消失及相应的肾功能进行性下降，最终病情发展成终末期肾病。大量实验［7-8］证实，随着肾间质纤维化程度的加深，Ⅲ型胶原的沉积也随之增多，表明Ⅲ型胶原促进了小管间质纤维化。Col-IV在肾小管上表达异常增多的程度影响肾脏组织结构病理的改变、肾间质纤维化、肾小管萎缩及炎症细胞浸润，Col-IV分布与系膜增生相一致［9］。相关研究表明［10］，Col-Ⅳ与肾纤维化成正相关，故早期抑制肾间质纤维化对延缓DN的进展至关展有重要。

DN属中医“消渴”“水肿”“尿浊”等范畴。属本虚标实之证，以五脏之气、血、阴、阳虚为本，以痰凝、瘀血、湿浊为标。因此治疗应以益肾为本，固其封藏，正其开阖，兼以化痰除湿、活血通络。本课题组中的加味芪黄饮，由中医治疗消渴虚劳方六味地黄丸、参芪地黄汤等化裁而成。方中黄芪为君药，益气固脱，利水消肿，摄血藏精；臣以太子参补中益气，健脾生津，山茱萸、生地、女贞子、山药、滋补肝肾健脾，涩精固脱；牡丹皮活血散瘀，泽泻利水渗湿化浊，茯苓补气健脾，溪黄草清热利湿，白茅根、蝉蜕清热解毒，共为佐使，全方有益肾固精，化瘀清利之功。大量研究表明［11-12］，中药能从多方面起作用，以减轻肾脏的ECM积聚，防止肾纤维化。中药不仅能抑制导致肾纤维化的各种细胞因子，降解ECM成分的积聚，而且有些药物能直接抑制ECM相关组成成分的合成。本研究以加味芪黄饮治疗DN大鼠，发现其降低DN大鼠的24 h UAlb、Scr、BUN、FBG水平，推测加味芪黄饮对肾间质纤维化有一定的治疗，可能通过下调Col-Ⅲ及Col-Ⅳ在肾间质的表达，抑制细胞外基质的增生、积聚，从而达到保护肾脏、防止肾间质纤维化的作用，延缓病程，且随剂量增加疗效更显著。

综上所述，加味芪黄饮治疗DN疗效确切，其可能通过下调肾组织Col-Ⅲ、Col-Ⅳ的表达，延缓DN进展。