穿龙薯蓣皂苷元对DBA1/J小鼠CD4+CD25-T细胞的影响

梁秀军，董永彩，李 强，陈 萌，田焕娜，赵晓菲

（1.承德医学院，河北承德 067000； 2.承德钢铁集团有限公司职工医院）

调节性T细胞（Treg）是一类具有负向免疫调节功能的CD4+T细胞亚群，对多种自身免疫性疾病有抑制作用[1]。Treg细胞的分子标志通常为CD25，并且特异性表达Foxp3，Treg细胞可以通过分泌IL-10等抑制性细胞因子发挥负向免疫调节作用[2]，CD4+CD25-T细胞则作为效应细胞参与免疫应答。近年来许多研究发现系统性红斑狼疮（SLE）、类风湿关节炎（RA）等多种自身免疫疾病中Treg细胞比例显著降低[3]。实验结果证实，在体外可用CD4+CD25-T细胞为前体细胞，通过诱导干预，使CD4+CD25-T细胞转化为Treg细胞[4]。

本课题组前期实验结果显示穿龙薯蓣皂苷元可调节CD4+T细胞亚群、减少炎性因子的产生，对类风湿关节炎有一定治疗作用[5]，但具体作用机制仍在进一步研究。本实验以雌激素作为阳性对照药物[6]，通过研究穿龙薯蓣皂苷元对CD4+CD25-T细胞上清中细胞因子IL-10浓度、Treg细胞Foxp3 mRNA水平及Treg细胞比率影响，旨在初步研究穿龙薯蓣皂苷元对CD4+CD25-T细胞转化为CD4+CD25+Treg细胞的诱导作用，为穿山龙治疗RA的开发应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性DBA1/J小鼠，SPF级，30只，7～8周龄，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号码：SCXK(沪)2012-0002。

1.2 主要试剂

The CD4+CD25+Regulatory T Cell Isolation Kit mouse，德国Miltenyi Biotec公司；CD3单抗、CD28单抗，Biolegend公司；mouse rIL-2，Peprotech公司；雌二醇，Solarbio公司；Mouse IL-10 ELISA Kit，美国Biolegend公司；Mouse Regulatory T Cell Staining Kit #3，美国Ebioscience公司；SYBR Premix Ex TaqTM II 试剂盒、Foxp3引物、GAPDH引物，中国大连宝生物工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 制备小鼠脾细胞悬液 在超净工作台中摘取DBA1/J小鼠脾脏，置于装有培养液的玻璃培养皿中。小鼠脾脏被400目尼龙滤网包裹，用研磨棒轻轻研磨脾组织。吸取脾组织滤液，将滤液再次过400目滤网，并收集组织滤液。用红细胞裂解液裂解脾脏中红细胞后，300g离心10min，再用PBS洗涤脾淋巴细胞2次。

1.3.2 CD4+CD25-T细胞的分选 采用免疫磁珠细胞分离术（MACS），将上述裂红后的脾淋巴细胞悬液，严格按照分离柱试剂盒说明书分选小鼠脾脏CD4+CD25-T细胞，得到CD4+CD25-T细胞。

1.3.3 CD4+CD25-T细胞的活性和纯度检测 CD4+CD25-T细胞常规台盼兰染色判定细胞活性。采用流式细胞术（FCM）检测分离获得的CD4+CD25-T的纯度。

1.3.4 CD4+CD25-T细胞体外培养及分组 96孔板中各孔加200μl CD4+CD25-T细胞(2×105个)，各孔中再加入5μg/mL CD3抗体、1μg/mL CD28抗体、1000U/mL rIL-2。 将CD4+CD25-T细胞分为空白对照组；穿龙薯蓣皂苷元高、中、低组；阳性对照组五组。阳性对照组加入25ng/mL雌二醇。共培养48h后，收取细胞检测。

1.3.5 ELISA法检测IL-10的水平 按上述方法实验分组，细胞培养48h后，用ELISA法检测各组培养上清中IL-10的浓度。

1.3.6 Real-Time PCR方法检测Foxp3的表达 按上述方法实验分组，细胞培养48h后，收集各组细胞用实时荧光定量PCR方法检测Foxp3的表达。Foxp3引物序列：上游引物 5’-AGTGCCTGTGTCCTCAATGGTC-3’，下游引物5’-AGGGCCAGCATAGGTGCAAG-3’；GAPDH引物序列：上游引物 5’-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3’，下游引物 5’-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3’。

1.3.7 FCM检测Treg细胞比例 按上述方法实验分组，细胞培养48h后，用FCM检测Treg细胞比率。

1.4 统计学分析处理

2 结果

2.1 CD4+CD25-T细胞活性及纯度检测

免疫磁珠术分选出的C D4+C D25-T经盼兰染色，CD4+CD25-T细胞活性达90%以上。FCM检测得CD4+CD25-T细胞纯度为93.89±0.16，细胞纯度达到90%以上，见图1：

图1 CD4+CD25-T细胞的纯度

2.2 ELISA法测IL-10水平结果

药物作用CD4+CD25-T细胞48h后，与对照组相比，穿龙薯蓣皂苷元组培养上清中IL-10浓度显著升高（P＜0.05），见图2：

图2 各组细胞上清中IL-10的水平

2.3 Real-Time PCR方法检测Foxp3结果

药物作用CD4+CD25-T细胞48h后，与对照组相比，穿龙薯蓣皂苷元组Foxp3 mRNA表达水平明显上升（P＜0.05），见图3：

图3 各组细胞Foxp3的表达

2.4 各组Treg细胞比率结果

药物作用CD4+CD25-T细胞48h后，与对照组相比，穿龙薯蓣皂苷元组Treg细胞比率明显上升（P＜0.05），见图4，图5：

图4 各组细胞Treg细胞比例

图5 各组细胞Treg细胞比例

3 讨论

CD4+T细胞是参与机体适应性免疫应答的重要细胞，其中Treg细胞是一类重要的负向免疫调节细胞，其表面高表达CD25分子，并且Foxp3是CD4+CD25+Treg细胞特异性转录因子，由此与作为免疫应答效应细胞的CD4+CD25-T区别开来。抗炎因子IL-10通过活化的巨噬细胞来抑制炎症因子如TNF-α、IL-6、IL-1的表达，并限制由炎症引起的组织破坏，Treg细胞则可通过产生IL-10、TGF-β等细胞因子来控制自身反应性[7]。

近年多项研究证实，RA等多种自身免疫病患者体内，Treg数量显著低于正常水平[8]。有研究显示，在体外可用CD4+CD25-T细胞为前体细胞，通过诱导干预，使CD4+CD25-T细胞转化为Treg细胞[9,10]。因此通过诱导干预，使CD4+CD25-T细胞转化为在体内含量很低的Treg细胞已成为治疗自身免疫病的新靶点。

穿山龙为薯蓣科植物穿龙薯蓣的根茎，祖国医学认为，其具有舒筋活血、祛风除湿的作用。穿山龙主要药用成分为穿龙薯蓣皂苷，由于在机体内代谢后皂苷最终转化为皂苷元被机体吸收，并发挥治疗的作用，所以本实验采用薯蓣皂苷元作为实验药物。薯蓣皂苷元具有雌激素样作用[11]，而雌激素又能诱导CD4+CD25-T细胞转化为CD4+CD25+Treg细胞[6]，故选用雌激素作为阳性对照药物。

为更加明确穿龙薯蓣皂苷元的作用，本实验采用MACS法分选出高纯度的CD4+CD25-T细胞，对其直接进行药物作用。结果显示，穿龙薯蓣皂苷元能明显升高CD4+CD25-T细胞上清中免疫抑制性细胞因子IL-10的水平，提高Treg细胞Foxp3mRNA的水平及Treg细胞比率，证明穿龙薯蓣皂苷元能诱导DBA1/J小鼠脾脏CD4+CD25-T细胞向Treg细胞转化，为穿山龙治疗RA作用机制的研究及穿山龙的开发应用提供实验依据。