牡荆素通过调节miR-409表达逆转异氟醚诱导的神经损伤

齐英凯，杨 波，尤 莹，聂 宇，张 康

（1.沧州市中心医院麻醉科，河北沧州 061000； 2.承德市中心医院）

据研究显示，全球每年有超过20亿人需要手术治疗，术中常用异氟醚进行麻醉，是最常用的吸入麻醉药之一[1]，然而，最新的研究表明，异氟醚具有神经毒性，增加神经元凋亡，减少神经发育，尤其是与患者术后认知功能障碍有关[2-4]。因此，寻找能够有效预防或逆转这些神经毒性作用的药物尤为重要。据研究显示类黄酮类化合物牡荆素可以降低血压和脂质过氧化作用，并增加冠状动脉血流量，从而对心肌缺血性损伤具有保护作用，还会抑制乙酰胆碱酯酶活性，从而促进神经元发育和神经再生[5,6]。 我们前期研究发现牡荆素对异氟醚诱导的大鼠神经细胞损伤具有明显的保护作用[7]，但具体的保护机制并未完全阐明， 因此本研究用异氟醚诱导SD大鼠神经损伤模型，探索牡荆素可能的保护机制，本研究可能会对异氟醚诱导的神经毒性治疗药物的发现提供新见解。

1 材料与方法

1.1 实验材料

50只雄性SD大鼠（200～250 g）从中国沧州市中心医院实验动物中心获得，在12h光照/12h黑暗以及恒定的室温（21±2°C）下饲养。所有动物实验均通过伦理委员会批准。牡荆素（西安昊轩生物科技，批号：2018030）；异氟醚（Baxter，美国）；miRNA提取试剂盒（Sigma-Aldrich，美国）；TUNEL试剂盒（武汉博士德公司）；Morris水迷宫（成都泰盟软件有限公司）；荧光显微镜（Olympus，日本）。

1.2 实验方法

1.2.1 模型建立及干预方法 将大鼠随机分为5组，每组10只：模型组，牡荆素低、中、高剂量组及对照组。对照组，正常喂养，不做处理；模型组，牡荆素低、中、高剂量组均置于麻醉诱导箱内吸入2%异氟醚与氧气的混合气体2h，牡荆素低、中、高剂量组分别静脉注射给以牡荆素：1 mg/kg、3 mg/kg、10 mg/kg。牡荆素溶于生理盐水，每只大鼠每次尾静脉注射1ml，每天1次，连续治疗14d。模型组大鼠尾静脉注射给以等体积生理盐水。

1.2.2 实验检测大鼠学习记忆能力 给药结束后，用Morris水迷宫实验对大鼠进行学习和记忆测试。Morris水迷宫的直径为150cm，并用水（22±1℃）填充至直径15cm的可移动平台顶部上方1.5cm的高度。用安装在池上方的摄像机跟踪大鼠，该摄像机连接到运行IMAQ PCI-1407软件的计算机。两次实验之间的间隔时间至少为60min。

给以牡荆素14d后，采用定位航行实验进行测试。将平台放置在目标象限中，将大鼠从随机象限开始，测定其逃避潜伏期（ELP）：在120s内找到平台所需时间，如果大鼠在120s内未能找到隐藏的平台，则将它们引导至平台，并在平台上停留10s，本次测试逃避潜伏期记录为120s。每日3次，每次大鼠入水象限不同，连续5d，记录每组大鼠ELP。

完成5d定位航行实验后24h，进行空间探索实验测试。移走水池中的平台，大鼠从平台所在象限对角线位置象限入水，进行测试，记录大鼠在目标象限（定向航行实验平台所在象限）停留的时间和穿过平台的次数。

1.2.3 PCR检测大鼠海马组织miR-409表达 SD大鼠脊椎脱臼法处死，断头后用75%的酒精消毒，剪开脑部的皮肤后分离出颅骨，使双侧大脑暴露后，分离出双侧的大脑半球，立即转移至含D-Hank液的培养皿中，小心分离皮层并取出两侧海马组织，D-Hank液中漂洗3次后分离血丝和脑膜，得海马组织，将一侧海马组织制成海马神经细胞悬液[7]。miRNA提取试剂盒提取miRNA；使用miRcute miRNA第一链cDNA合成试剂盒进行miRNA逆转录；miR-409的定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）用mir-Vana RTqPCR miRNA检测试剂盒进行荧光定量pcr检测；采用U6作为内参，使用2-ΔΔCt方法表示miRNA表达水平。

1.2.4 TUNEL检测细胞凋亡

将分离出的一侧海马组织，用4%中性甲醛固定制备石蜡切片，TUNEL细胞检测试剂盒检测细胞凋亡。用0.1%磷酸缓冲液（pH 7.4）中的4%多聚甲醛固定。用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤后，用0.2%Triton-X 100的甲醇溶液于4℃下透化2min。然后将细胞与TUNEL试剂在37°C孵育60 min。PBS洗涤，荧光染色。荧光显微镜下观察，凋亡细胞细胞核呈绿色荧光。每个标本随机选取6个视野计算阳性细胞数，以阳性细胞数/100计算凋亡指数。

1.3 统计学分析

采取SPSS 22.0统计学软件进行数据分析。计数资料用率表示，采取χ2检验。计量资料采用均数±标准差表示，组间比较采取独立样本t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 牡荆素对大鼠学习记忆功能影响

在定位航行实验中，各组逃避潜伏期随着天数的增加逐渐缩短，模型组大鼠到达平台所需的时间较对照组明显增加（P＜0.01）；低剂量牡荆素组大鼠与模型组相比逃避潜伏期未见明显降低，中、高剂量牡荆素大鼠组逃避潜伏期显著降低（P＜0.05，P＜0.01），见图1。空间探索实验中，模型组大鼠与对照组相比，目标象限停留时间明显下降（P＜0.001）；中、高剂量牡荆素组大鼠与模型组相比，目标象限停留时间明显升高（P＜0.05，P＜0.01），见图2。模型组大鼠与对照组相比穿越平台次数明显减少（P＜0.001）；中、高剂量牡荆素组大鼠与模型组相比穿越平台次数明显增多（P＜0.05，P＜0.01），见图3。

图1 各组大鼠逃避潜伏期

图2 各组大鼠在目标象限停留时间

图3 各组大鼠穿过平台次数

2.2 牡荆素对大鼠海马组织miR-409表达的影响

模型组与正常对照组相比海马组织miR-409的表达显著性降低（P＜0.001）；牡荆素组与模型组相比，中、高剂量牡荆素组增加海马组织miR-409的表达（P＜0.05，P＜0.01），见图4。

图4 各组大鼠海马组织miR-409表达的影响

2.3 牡荆素对海马细胞凋亡的影响

模型组与对照组相比，可显著增加海马细胞凋亡指数（P＜0.001）；与模型组相比，中、高剂量牡荆素组显著降低凋亡指数（P＜0.05，P＜0.01），见图5。

图5 各组海马细胞凋亡情况

3 讨论

有研究表明，异氟醚具有潜在的神经毒性，可引起神经系统的剂量和时间依赖性损害，在动物模型中的研究表明，异氟醚可以诱导整个大脑，包括海马和大脑皮层的神经元凋亡，引起空间学习和记忆障碍[8,9]。本研究中，异氟醚神经损伤模型组大鼠在水迷宫定位航行实验中的逃避潜伏期延长；空间探索实验中，其目标象限停留时间和在平台出现次数减少，表明异氟醚损害大鼠的学习和记忆能力。牡荆素中、高剂量组大鼠在水迷宫定位航行实验中，逃避潜伏期缩短；空间探索实验中，其在目标象限停留时间和平台出现次数增加，表明牡荆素可改善异氟醚神经损伤大鼠的学习记忆能力。

miRNA是一类内源性非编码小RNA，它通过与靶基因的3'端非翻译区结合，在转录后上调其靶基因的表达，进而调控多种生物学过程。大多数miRNA在中枢神经系统中大量表达，并在大脑发育和神经系统疾病中发挥重要作用，其可能参与了异氟烷引起的学习和记忆障碍[10-12]。miR-409属于miRNA家族的一员，随着研究的深入，越来越多的证据表明多种疾病的发生中存在其异常表达。miR-409在肿瘤中的表达高低，与肿瘤的发生发展及预后密切相关；急性缺血性脑卒中患者外周血中，miR-409表达水平明显降低。miR-409成为近年来研究的热点。在本研究中，异氟醚神经损伤模型组海马组织miR-409的表达显著性降低，牡荆素可以增加miR-409的表达。同时，异氟醚神经损伤模型组海马组织凋亡增多，牡荆素可以减低异氟醚神经损伤大鼠海马组织凋亡。这些结果表明，miR-409过表达可以减缓异氟醚诱导的神经毒性。

综上所述，异氟醚可损害海马依赖性大鼠的学习和记忆能力，而中高剂量的牡荆素可能通过上调miR-409的表达，抑制海马细胞凋亡，显著减少异氟醚引起的损伤，提升学习记忆能力，但其具体机制尚不清楚。因此，牡荆素可能是神经毒性药物治疗中有希望的候选药物，但尚需要进一步的研究以确证。

（收稿日期：2020-10-31）