青花椒挥发油固体脂质纳米粒的制备及质量评价

王茹嫣，许路路，赵凤平，赵宇明，韩静*

沈阳药科大学制药工程学院（沈阳 110016）

青花椒（Zanthoxylum schinifoliumSieb.et Zucc，Z.schinifolium）也被叫作川椒、青椒，是芸香科（Rutaceae）花椒属植物中的一种，有温中助阳、散寒躁湿、止痒、驱虫等功能[1]。青花椒的化学成分主要有10%挥发油、10%山椒素、20%黄酮类等，并且具有良好生物活性[2]。在青花椒挥发油的组分分析和生物活性上，挥发油中85%芳樟醇与5%柠檬烯是其发挥抑菌作用的主要成分[3]，并且对革兰氏阳性菌有显著抑菌作用[5]。Hellen等[4]认为长期使用抗生素会激发真菌mdr2基因，导致ABC转运体的表达增多，产生耐药性。芳樟醇与抗生素联用，会抑制mdr2基因表达，起到联用效果。

青花椒挥发油容易被氧化从而失去生理活性，氧化程度20 mmoL/L仅能作为香水；同时挥发油氧化物对皮肤致敏，不可见的人体反应为250 mg/kg；可见的人体反应为1 000 mg/kg[6]。青花椒挥发油的水不溶性以及生物利用度差阻碍抑菌作用在临床方面应用。

青花椒挥发油纳米粒作为局部给药制剂时，相较其他纳米制剂，脂质体、纳米乳、胶束等，优点包括：有效物质更好地免受外部物质的氧化；增强活性物质在角质层的渗透性；包封活性成分不易泄漏；可控释放；生物可降解，对人体的毒性低。

这些优点为青花椒挥发油局部给药制剂时在临床上的研究与开发提供理论思路[7]。

1 仪器与材料

日立Primaide高效液相色谱仪；马尔文激光粒度仪（英国Malvern公司）；ATY124精密电子天平（万分之一，日本Shimadzu公司）；SHA-BA水浴恒温振荡器（江苏科析仪器有限公司）；高速离心机（湘仪离心机仪器有限公司）；高速多功能粉碎机（上海缘沃工贸有限公司）。

青花椒（云南泰瑞农林发展有限公司）；芳樟醇对照品（上海麦克林生化科技有限公司）；棕榈酸（九鼎化学有限公司）；单硬脂酸甘油酯、硬脂酸（天津市博迪化工有限公司）；gelucire 44/14、LABM 2125 CS、geclucire 50/13（嘉法狮贸易有限公司）；丙三醇、乙醇、吐温20、吐温40（天津市富宇精细化工有限公司）；吐温80（天津市科密欧化学试剂有限公司）；泊洛沙姆-188、泊洛沙姆-407（阿拉丁控股集团有限公司）；十八醇（玛雅试剂有限公司）；PEG 400（国药集团化学试剂有限公司）；1, 2-丙二醇（天津市永大化学试剂有限公司）。

2 方法与结果

2.1 挥发油测定方法的建立

2.1.1 色谱条件

色谱条件：日立Supersil ODS C18液相色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；检测波长205 nm；流动相：乙腈-水（50∶50，V/V）；流速：1.0 mL/min；柱温30 ℃，进样量10 μL[8]。

2.1.2 标准曲线

精确称取0.06 g芳樟醇对照品，用乙腈溶解后定容转移到10 mL容量瓶中得72.5 mg/mL母液。精确量取一定母液，用乙腈稀释成0.011，0.022，0.033，0.044，0.055，0.071 5和0.088 mg/mL标准稀释溶液。以芳樟醇质量浓度（x）对峰面积（y）作线性回归，得回归方程y=2×107x-19 548（R2=0.999 6）。结果表明在0.011～0.088 mg/mL药物质量浓度内的线性关系良好。

2.1.3 样品处理

取100 g花椒颗粒放入烧杯中，用高速多功能粉碎机进行粉碎，过筛，参照药典挥发油提取法提取青花椒挥发油，液料比10∶1（mL/g），时间4.5 h，提取次数3次，用烧杯接住挥发油提取器的油层，用5 mL左右的乙酸乙酯冲洗管壁，冲掉残余油相，加入无水硫酸钠静置24 h除去水分得到青花椒挥发油[9]。

2.2 青花椒挥发油纳米粒包封率（EE）的测定

取0.5 mL载药固体脂质纳米粒溶液置于超滤管（规格0.5 mL，100 kDa）膜中，盖外盖，超滤管置于5 mL离心管，置于10 mL离心管，以3 500 r/min离心10 min，收集所有下层滤液至10 mL容量瓶中，加入乙腈稀释，定容；另取0.5 mL固体脂质纳米粒溶液，至10 mL量瓶中，加入乙腈进行破乳溶解，定容。分别取上述两种溶液过0.22 μm有机滤膜，得到续滤液，用2.1.2的方法进行测定，按式（1）计算包封率。

式中：Cfree游离为SLNs溶液中未被包封的青花椒挥发油质量；Ctotal为SLNs溶液中青花椒挥发油总量[10]。

2.3 青花椒挥发油纳米粒的制备

青花椒挥发油纳米粒采用微乳法制备，将高熔点脂质载体在65～70 ℃加热融化，加入药物、表面活性剂及助表面活性剂，加入10 mL温水制成外观透明、热力学稳定的微乳，将微乳分散在20 mL冷水中，即得SLNs分散体系[11]。

2.4 处方优化

2.4.1 单因素考察

2.4.1.1 脂质载体

选用不同类型的脂质材料：棕榈酸、单硬脂酸甘油酯、硬脂酸、gelucire 44/14、gelucire 50/13、LABM 2125 CS，表面活性剂吐温80，助表面活性剂丙三醇，按照2.3的方法制备青花椒挥发油纳米粒。对SLNs的表观、包封率进行观察。结果发现gelucire 50/13的现象与gelucire 44/14类似，呈现澄清泛蓝，但是gelucire 50/13的包封率更高，故选择gelucire 50/13为脂质载体。

表1 不同脂质材料对青花椒挥发油纳米粒表观、包封率的影响

2.4.1.2 表面活性剂

选用吐温20、吐温40、吐温80、泊洛沙姆-188、泊洛沙姆-407为表面活性剂；脂质载体gelucire 50/13，助表面活性剂丙三醇，按照2.3的方法制备青花椒挥发油纳米粒，对SLNs的表观、包封率进行观察。根据表2结果，选择吐温80作为表面活性剂。

表2 不同表面活性剂对青花椒挥发油纳米粒的表观、包封率的影响

2.4.1.3 助表面活性剂

选用十八醇、PEG 400、丙三醇、1, 2-丙二醇、乙醇为助表面活性剂；脂质材料G50/13，吐温80为表面活性剂。按照2.3的方法制备青花椒挥发油纳米粒，对SLNs的表观、包封率进行观察。如表3所示，选择丙三醇作为助表面活性剂。

2.4.2 Box-Behnken设计-响应面法优化试验

考察丙三醇助表面活性剂质量浓度（X1，g/L）、药脂比（X2）、吐温80表面活性剂质量浓度（X3，g/L）对青花椒挥发油纳米粒的粒径与包封率的影响，采用Box-Behnken设计-响应面法优化试验方法，以纳米粒的粒径、包封率作为评价指标，优化纳米粒处方，并得到最佳处方配比。其因素与水平见表4，试验安排及结果见表5。

表3 不同助表面活性剂对青花椒挥发油纳米粒表观、包封率的影响

表4 Box-Behnken试验设计中的变量水平

表5 试验设计中的自变量（X）和因变量（Y）

2.4.3 数据处理及模型拟合

应用Design Expert 8.0.6试验软件对表5中试验结果进行方差分析及多元二次方程拟合，结果详见表6。多元二次回归方程可表示为Y=β0+β1X1+β2X2+β3X3+β12X1X2+β13X1X3+β23X2X3+β11X12+β22X22+β33X32，其中βi代表不同的回归系数。从表6的F值可以看出，药脂比对粒径、包封率的影响远大于表面活性剂与助表面活性剂；表面活性剂与助表面活性剂的交互作用较好。

应用Design Expert 8.0.6试验软件对表5中试验结果绘制响应面图以及等高线图。结果如图1（等高线图）所示，表面活性剂在3.67～4.67 g/L之间质量浓度增加导致粒径减少，很大可能是因为表面活性剂浓度决定纳米粒的总比表面积、扩散速度。在设定的处方范围内继续增加表面活性剂浓度会使粒径增大，因为浓度过大会抑制其移动速度，从而使乳化液滴聚结。

表6 固体脂质纳米粒拟合方程中各项系数及方差分析结果

图1 自变量A、B、C与因变量粒径、包封率的等高线图

2.4.4 优化与预测

根据Design-Expert 8.0.6试验设计软件得到的最佳处方为丙三醇质量浓度3.67 g/L、药脂比6∶1、吐温80质量浓度4.67 g/L。按照最优处方制备3批青花椒挥发油固体脂质纳米粒，分别测定粒径（Y1）和包封率（Y2），并与模型给出的预测值进行比较（见表7）。由结果可知，试验观察值和模型预测值的偏差的绝对值较小，不超过6%，说明模型预测的可行性良好。

表7 青花椒挥发油固体脂质纳米粒各指标预测值和观察值

2.4.5 粒径分布

使用最优配比制备纳米粒，储存条件：25 ℃，避光，30 d；粒径仪测量纳米粒，图2所示粒径30.34nm，PDI 0.307，表明纳米粒粒径分布较窄。

图2 青花椒挥发油固体脂质纳米粒的粒径分布

2.5 SLNs的体外经皮渗透试验

2.5.1 离体皮肤制备

于小鼠腹部涂抹脱毛膏进行脱毛处理后，用生理盐水洗净，饲养24 h后处死，剥离无毛的腹部皮肤，去除皮下脂肪，用生理盐水洗净，用滤纸吸干后，备用。

2.5.2 体外透皮吸收试验

图3 SLNs和原料药的体外渗透曲线

在直立式Franz扩散池中进行透皮吸收试验，于37 ℃恒温循环水浴中保温。将2.5.1处理好的小鼠离体皮肤固定在供给池和接收池中间，角质层部分朝向供给池，以生理盐水溶液作为接收液。取1.0 mL优化的SLNs及相同质量浓度的原料药作为对照，在300 r/min搅拌条件下，并于一定时间点吸取200 μL接收液，另取相同体积的生理盐水置于接收池中[12]。吸出的接收液经0.22 μm微孔滤膜滤过后，按2.1.1的色谱条件分析。从体外渗透曲线图（图3）可以看出，纳米粒与原料药相比有明显促进药物吸收作用，11 h后纳米粒积累渗透量25.02 μg/cm2，是原料的3.16倍。

3 讨论与结论

采用Box-Behnken设计响应面法优化试验，得到丙三醇质量浓度3.67 g/L，药脂比6∶1，吐温80质量浓度4.67 g/L，测得的粒径28.76±1.56 nm，PDI 0.108±0.023，EE 92.24%±3.48%。透皮试验结果显示，SLNs的累积渗透量提高约3.16倍，表明将原料药制成SLNs可显著提高其透皮性能[13]。可能的原因是纳米粒更易粘附在角质层表面，形成药物存储库，通过被动运输可达到皮肤深处；纳米粒的小粒径增大与角质层的接触面积。存放30 d后的纳米粒粒径仍可达30.34 nm，PDI为0.307，表明Box-Behnken法获得的最优配比具有一定的稳定性、可行性。