有氧糖酵解在胰腺癌中的研究

张 凯， 郭明洲， 张志谦

1.北京大学临床肿瘤学院暨北京市肿瘤防治研究所细胞生物学研究室，恶性肿瘤发病机制及转化研究教育部重点实验室，北京 100142；2.中国人民解放军总医院第一医学中心消化内科医学部

胰腺癌是所有恶性肿瘤中死亡率最高的一种消化道肿瘤。在世界范围内，胰腺癌的发病率在过去的30年里增加了1倍多[1]。在我国，胰腺癌是男性和女性癌症相关死亡的第六大原因[2]，它正成为越来越常见的癌症死亡原因，给人类健康事业带来巨大负担和挑战。胰腺癌的特征是由酸性缺氧的肿瘤微环境促进糖酵解增强，代谢重编程使癌细胞能够在恶劣的微环境中生存[3]。细胞能量代谢异常被发现和肿瘤发生发展关系密切，肿瘤细胞代谢已成为癌症研究的热门课题。因此，本文主要对胰腺癌在有氧糖酵解方面的研究作一概述，对胰腺癌有氧糖酵解发生的影响因素和关键酶及针对它们的临床靶向治疗进行归纳总结。

1 胰腺癌有氧糖酵解发生的影响因素

1.1 胰腺癌细胞缺氧微环境胰腺恶性肿瘤细胞通常只占肿瘤组织的极少部分，肿瘤组织中的其他成分由细胞外基质(extracellular matrix，ECM)、肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts，CAFs)、内皮细胞、免疫细胞和神经元等组成[4]，它们相互作用形成了肿瘤微环境(tumor microenvironment，TME)。TME占肿瘤体积的90%，它对肿瘤的发生和转移至关重要。大多数胰腺癌的血管系统非常差，低血供是胰腺癌影像学诊断的突出特征[5]，在胰腺癌中，缺氧和低血供微环境导致胰腺癌细胞有氧糖酵解增强。此外，胰腺癌的组织学特征是致密的纤维化间质，这会使肿瘤血管受到外部机械应力压迫从而恶化组织灌注，限制肿瘤细胞对氧气和营养物质的利用[6]。长期生存在严重缺氧和营养剥夺的环境中对细胞维持代谢稳态和生物大分子合成构成了重大挑战，胰腺癌细胞通过代谢重编程支持其能量和生物合成需求[7]。

1.2 低氧诱导因子(hypoxia inducible factors，HIFs)HIFs是对肿瘤微环境和代谢有广泛影响，并在细胞感知和适应氧含量变化的功能中起着重要作用的转录因子[8-9]。HIF的水平和活性主要由其α亚基控制，常氧条件下HIF-α亚基受脯氨酰羟化酶介导的氧依赖性羟基化作用，促进它被泛素化修饰降解，缺氧抑制羟基化进而维持HIF-α亚基稳定性[10-11]。在肿瘤缺氧的微环境中，HIF-1α可以通过稳定上调己糖激酶Ⅱ(HK2)、乳酸脱氢酶A(LDHA)、磷酸甘油酸激酶1(PGK1)和丙酮酸激酶M2(PKM2)等糖酵解酶的表达促进葡萄糖吸收和糖酵解[12-14]。

HIF-1α的高表达已经在胰腺癌中证实[5]，根据Oncomine和TCGA等数据库分析结果[15]，在胰腺癌中P4HA1的高表达依赖HIF-1α并提示预后不良。HIF-1α和P4HA1之间存在正反馈通路，P4HA1可以提高HIF-1α的蛋白水平和转录活性，并增强其稳定性。P4HA1-HIF-1α通路是胰腺癌糖酵解和致癌活性的关键调控因子，它能驱动胰腺癌的糖酵解和不良进展，敲低P4HA1显著抑制了胰腺癌细胞的糖酵解活性和恶性表型[15]。除此之外，在人类胰腺癌组织中，HIF-1α和HIF-2α过表达与乳酸脱氢酶A(Lactate dehydrogenase A，LDHA)过表达具有很强的相关性[16]，荧光染色结果显示，在85%或83% LDHA阳性的胰腺癌样品中观察到HIF-1α和HIF-2α阳性染色，但在LDHA阴性的样品中这个比例只有14%或19%。低氧诱导的LDHA表达依赖于具有HRE-D的启动子，在低氧条件下，HIF-1α或HIF-2α均与LDHA启动子中的HRE-D相互作用，抑制内源性HIF-1α或HIF-2α可显著降低缺氧诱导的LDHA水平，进而抑制胰腺癌细胞的糖酵解水平和增殖能力[16]。

1.3 胰腺癌细胞基因突变胰腺癌的发生很大程度上是由某些致癌基因和抑癌基因的突变导致的，KRAS、CDKN2A、TP53和SMAD4的突变被认为是胰腺癌发生的主要驱动因素[17]，这些基因的突变是促进胰腺癌有氧糖酵解的重要原因。一项实验数据表明，约93%的胰腺癌中存在KRAS癌基因突变[18]。胰腺细胞KRAS突变可引起多种代谢重编程，为细胞增殖创造有利环境，加速癌变进程，MAPK通路和Myc调控的转录控制在胰腺癌KRAS突变介导的代谢重编程中起关键作用[19-20]。胰腺癌细胞处于缺氧的环境中，KRAS激活性突变增强了缺氧诱导的HIF-1α和HIF-2α的稳定性，从而导致HIF-1α的下游调控分子CA9表达水平的升高[21]。在胰腺癌细胞中，CA9的敲低或药物抑制会损害它们在缺氧时调节pHi的能力，潜在地抑制肿瘤生长和扩散，而CA9水平的升高能促进代谢方式向糖酵解的转变[21]。此外，KRASG12D突变通过调节葡萄糖摄取和随后的代谢步骤对葡萄糖利用至关重要，当胰腺癌细胞中KRASG12D突变表达增加时，伴随着葡萄糖转运蛋白(GLUT1)、己糖激酶(HK1、HK2)、磷酸果糖激酶1(PFK1)、烯醇化酶-1(ENO1)和LDHA表达水平的升高，葡萄糖摄取和乳酸生成增加，从而促进胰腺癌糖酵解水平增强[20]。

在约70%的胰腺癌中，肿瘤抑制基因TP53发生突变，这种突变造成p53突变体蛋白构象发生改变从而获得癌基因的功能，进一步激活了胰腺癌的侵袭性并改变了胰腺癌细胞的代谢方式[22]。突变型p53不改变糖酵解酶甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的表达水平，但它可以通过增强SIRT1:GAPDH复合体相互作用、抑制AMPK和激活AKT信号通路来抑制GAPDH的核转位，增强GAPDH糖酵解活性和乳酸分泌从而支持胰腺癌细胞的糖酵解。GAPDH胞质稳定及糖酵解活性有助于突变型p53的致癌作用[22]。

SMAD4是胰腺癌的一种特异性肿瘤抑制基因，据报道，约50%的胰腺癌中会发生SMAD4突变[23]。SMAD4的功能缺失突变与肿瘤侵袭、不良进展和较差的预后有显著相关性[24-26]。SMAD4表达结合TGF-β介导的刺激能显著降低胰腺癌细胞外酸化率并增加氧消耗率，它的缺失导致了胰腺癌的代谢重编程，在胰腺癌细胞中敲低SMAD4增强了胰腺癌细胞糖酵解能力并降低了线粒体功能[27]。SMAD4缺失在胰腺癌发生和代谢重编程中的作用依赖PGK1，TGF-β/SMAD4信号通路能抑制糖酵解酶PGK1的表达。PGK1在SMAD4缺失诱导的胰腺癌中表达上调，从而增强胰腺癌的有氧糖酵解和侵袭性行为[27]。

2 胰腺癌有氧糖酵解关键酶

2.1 HK2己糖激酶(Hexokinases，HKs)可以将葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷酸，是调节糖酵解的关键酶。HKs由HK1、HK2、HK3和HK4四种亚型组成，它们在不同的组织中呈不同程度表达[28]。与癌旁健康组织相比，HK2在大多数胰腺癌患者的肿瘤组织中表达上调[29]。在接受手术治疗的胰腺癌患者中，HK2的表达与较短的总生存期相关，HK2表达的增加在胰腺癌中促进肿瘤侵袭，而其表达的下调可抑制肿瘤细胞扩散和向远处器官的定植[30]。HK2在胰腺癌细胞中的表达受到长链非编码RNA(lncRNA)和microRNA(miRNA)的调控。lncRNA HOTAIR是胰腺癌中HK2的上游调节因子[29]，在胰腺癌肿瘤组织和血清中，HOTAIR和HK2的表达均高于健康对照组，并随着肿瘤进展表达水平进一步升高。HOTAIR的上调促进了HK2的表达从而导致胰腺癌细胞中葡萄糖摄取、乳酸和ATP生成的增加，在胰腺癌的恶性进程中发挥了重要作用[29]。而miR-202在胰腺癌中低表达，它的低表达与胰腺癌患者预后不良相关。在胰腺癌组织中，miR-202的表达与HK2水平呈负相关，HK2是miR-202的直接靶点，miR-202通过抑制HK2的表达抑制胰腺癌细胞糖酵解和增殖能力，进而抑制胰腺癌的进展[31]。

2.2 PGK1磷酸甘油酸激酶(Phosphoglycerate kinase，PGK)是一种产生能量的糖酵解酶，它催化磷酸基从1，3-二磷酸甘油酯(BPG)转移到ADP，产生3-磷酸甘油酸(3PG)和ATP[32]。PGK不仅在糖酵解中发挥作用，而且还作为二硫化物还原酶参与血管生成过程[33]。PGK1和PGK2同工酶在结构和功能上是相似的[34]，PGK2仅在精子形成过程中表达，缺乏PGK2的雄性精子的活力和ATP水平显著降低[35]。PGK1作为一种蛋白激酶在协调糖酵解和三羧酸循环中发挥重要作用，它可以被O-GlcNAc糖基化可逆地动态修饰，O-GlcNAc糖基化激活PGK1活性并诱导PGK1转位到线粒体。在线粒体内PGK1作为一种激酶激活丙酮酸脱氢酶激酶1(PDHK1)磷酸化并抑制丙酮酸脱氢酶(PDH)复合物，降低线粒体丙酮酸利用率以减少氧化磷酸化，同时增加乳酸的产生[36-37]。在胰腺癌患者肿瘤组织切片样本中PGK1蛋白水平升高，胰腺癌患者的血清PGK1水平也明显高于健康对照组，这表明PGK1可能是胰腺癌的一种新的血清标志物[38]。PGK1的表达受转录因子NFAT5的调控，在NFAT5敲低的胰腺癌细胞系中PGK1表达水平显著降低[39]。通过TCGA等数据库分析和免疫组化验证表明，在胰腺癌中NFAT5高表达，并与较差的预后相关。NFAT5通过增强胰腺癌细胞的糖酵解作用调控胰腺癌进展，而PGK1是NFAT5主要靶基因之一，NFAT5通过PGK1的转录表达促进有氧糖酵解因而有利于胰腺癌细胞的生存[39]。

2.3 PKM2丙酮酸激酶(Pyruvate kinases，PK)催化ADP和磷酸烯醇式丙酮酸转化为ATP和丙酮酸，是催化糖酵解最后一步的酶，它共有四种同工酶，分别为PKM1、PKM2、PKL和PKR[40]。PKM1和PKM2的表达均影响胰腺癌细胞的迁移和侵袭能力，但在异种移植瘤模型中，只有抑制PKM2才能抑制肿瘤转移[41]。胰腺癌细胞中PKM2的表达高于临近非癌组织，其在胰腺癌细胞的代谢活动和恶性过程中起着重要作用，敲低PKM2会导致糖酵解活性降低，并降低一些细胞内代谢产物如丙酮酸和多胺的水平[42]。PKM2是胰腺癌细胞侵袭和转移的关键调控因子，它通过磷酸化PAK2和促进PAK2-HSP90的关联来稳定PAK2，从而提高胰腺癌的细胞侵袭能力并促进肿瘤转移[41]。最新研究表明[43]，胰腺癌中PKM2的表达也受lncRNA的调控，lncRNA MIR210HG在胰腺癌组织中表达显著高于非癌健康组织，高表达MIR210HG的胰腺癌患者可能表现出更差的预后。MIR210HG是调控胰腺癌侵袭性和糖酵解的关键因子，它通过调控miR-125b-5p/HK2/PKM2通路调节胰腺癌细胞的侵袭性和糖酵解水平。MIR210HG的表达与HK2和PKM2的表达呈正相关，MIR210HG下调会降低HK2和PKM2的表达，导致葡萄糖摄取和乳酸分泌下降，从而抑制胰腺癌细胞糖酵解水平[43]。

2.4 LDHA血清乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase，LDH)水平能预测晚期胰腺癌吉西他滨化疗后的总生存期[44]。LDH有LDHA和LDHB两种亚型[45]，LDHA促进丙酮酸转化为乳酸而不是进入三羧酸循环[46]，它在糖酵解性肿瘤如胰腺癌中过表达，并与不良预后相关[47]，异常的LDHA表达水平是胰腺癌一个潜在的诊断标志[48]。LDHA通过HIF信号调节TME，LDH缺失可以通过改变TME来调节免疫反应，从而抑制肿瘤转移并延长小鼠的生存期[49]。

LDHA也通过与其他分子共同作用调控胰腺癌细胞有氧糖酵解。FOXM1是一种致癌转录因子，FOXM1直接与LDHA启动子区结合，FOXM1的过表达增加了LDHA在mRNA和蛋白质水平上的表达。增强的FOXM1-LDHA信号促进胰腺癌细胞生长和转移，并增加了乳酸的生成和葡萄糖的利用，对胰腺癌的有氧糖酵解和发生发展起着重要作用[50]。UCHL3在胰腺癌组织标本和细胞系中表达上调，并通过上调FOXM1的表达促进LDHA的表达，最终促进胰腺癌的发展。抑制UCHL3可以抑制胰腺癌细胞的增殖和有氧糖酵解，它可以作为预测胰腺癌进展的生物标志物[51]。免疫组化和qRT-PCR结果表明[52]，c-Myc和LDHA在胰腺癌中表达呈正相关，它们在胰腺癌细胞系和组织中均为高表达，胰腺癌患者c-Myc和LDHA高表达与TNM分期和肿瘤大小相关，常提示预后不良。异常调控的c-Myc-LDHA信号与肿瘤进展密切相关，并在胰腺癌的有氧糖酵解调控中发挥重要作用，敲低c-Myc降低了LDHA蛋白的表达和糖酵解水平，抑制c-Myc-LDHA通路诱导的有氧糖酵解能抑制胰腺癌进展[52]。

3 有氧糖酵解与胰腺癌治疗

有氧糖酵解不仅是多种肿瘤发生的危险因素，还与肿瘤的预后较差有关，肿瘤缺氧和有氧糖酵解是降低抗肿瘤治疗效果的重要因素[53]。因为糖酵解在细胞基础代谢中发挥了重要作用，靶向糖酵解治疗成了一个难题，寻找肿瘤细胞糖酵解的有效治疗靶点仍然非常困难[54-55]。针对胰腺癌有氧糖酵解的靶向治疗必须保证代谢过程或糖酵解酶的抑制对细胞正常功能不会造成损伤，目前对此已经有了相关研究。

胰腺癌缺氧反应的主要调节因子HIF是抗癌治疗的潜在靶点，多种针对HIF-1的治疗方法已经在研究。例如EZN-2968是一种特异性靶向HIF-1α的反义寡脱氧核苷酸，它在难治性实体瘤患者中进行了临床试验以评估其抗肿瘤效应[56]。抑制HIF的下游效应物，如HO-1，是另一种可能的靶向缺氧的治疗策略。HO-1是一种应激相关酶，缺氧诱导的HO-1转录激活被证明是由HIF-1介导的。HO-1的高表达与胰腺癌患者的不良预后显著相关，抑制HO-1可显著抑制胰腺癌细胞增殖，HO-1抑制联合吉西他滨治疗显著增强了肿瘤化疗的效果[57]。

IKA是一种自然产生并具有免疫调节和抗肿瘤等药理作用的抗生素[58]。转录组学和代谢组学的整合揭示了IKA可能通过阻断糖酵解来影响肿瘤代谢，HK2是IKA的作用靶点，IKA可以通过其亲水基团与HK2残基Glu742、Gln739、Glu708和Gln683形成5个氢键。通过靶向HK2阻断糖酵解，IKA减少葡萄糖消耗和乳酸生成，它在胰腺癌异种移植小鼠中抑制了肿瘤生长而无明显的细胞毒性，并在体外胰腺癌细胞中增强了吉西他滨的化疗敏感性，这提示IKA可能是胰腺癌治疗的潜在候选药物[58]。

胰腺癌细胞同时表达PKM2和LDHA，靶向糖酵解酶PKM2和LDHA从而抑制糖酵解也是一种很有前途的治疗胰腺癌的方法。PKM2激活剂TEPP-46和LDHA抑制剂FX-11处理后，血浆和肿瘤组织中PKM2酶活性升高，LDHA酶活性降低，而免疫组化结果显示肿瘤组织中PKM2和LDHA表达水平均降低。两者联合治疗可协同降低胰腺癌细胞增殖速率和生存能力，显著抑制小鼠移植瘤的生长并对小鼠的体质量、肝酶功能等无不良影响，具有良好的安全性[59]。

4 结论与展望

胰腺癌特殊的缺氧微环境及KRAS、TP53和SMAD4等基因的突变是导致胰腺癌有氧糖酵解发生的重要原因，糖酵解过程中HK2、PGK1、PKM2和LDHA等关键酶的异常表达促进了胰腺癌的发生发展。目前，针对胰腺癌有氧糖酵解的靶向治疗的基础研究很多，包括针对胰腺癌常见的突变基因、TME和有氧糖酵解的关键酶等，但真正推进到临床治疗并取得显著疗效的研究并不多。未来努力的方向应该更加重视有氧糖酵解在胰腺癌临床治疗方面的研究，以降低抑制有氧糖酵解的靶向治疗对正常细胞功能的损伤。相信随着对胰腺癌有氧糖酵解机制更深入的理解，会有更多安全有效的治疗靶点和治疗方法会被发现，以提高胰腺癌患者的生活质量和生存率。