基于网络药理学探讨干姜附子汤抗心肌缺血再灌注损伤的作用机制

谢锋，段广靖，王斌，卫培峰，陈琳，李敏（陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046）

心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia-reperfusion injury，MI/RI）[1]是指缺血缺氧的心肌组织恢复血液供应后，心脏结构的进一步破坏以及心肌细胞能量代谢功能障碍的进一步加重，甚至发生不可逆性损伤，主要包括心肌梗死面积的再扩大和危及生命的心律失常。目前，MI/RI的发病机制尚未完全阐明，一般认为钙超载、凋亡、氧化损伤、炎症是MI/RI 发生的重要原因[2-3]。

干姜附子汤记载于《伤寒杂病论•太阳病篇》，由干姜和附子配伍组成，相须使用可增强回阳救逆的功效，主治亡阳欲脱及中虚寒盛证。现代药理学研究表明，干姜附子汤具有抗休克、强心、增加冠状动脉血流量等作用[4-5]。史琴等[6]研究显示，干姜附子汤可降低MI/RI 大鼠心电图ST 段及心肌缺血面积。血清中乳酸脱氢酶（LDH）、心肌肌钙蛋白Ⅰ（cTn-I）及肌酸激酶同工酶（CKMB）含量明显下降，提示干姜附子汤对MI/RI 大鼠有保护作用，但其生物过程及具体机制仍不清楚。网络药理学（network pharmacology）是研究中药复方多成分、多靶点、多通路作用机制的重要手段[7-11]，本研究拟通过网络药理学对干姜附子汤治疗MI/RI 的作用机制进行预测分析并进行实验验证，为其深入研究提供基础。

1 材料

1.1 仪器及试药

胎牛血清（美国Kirge 公司，批号：20190907）；ATP 酶试剂盒（碧云天生物科技有限公司，批号：20191205）；细胞凋亡检测试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20200102）；ELx808 全自动酶标仪（美国BIOTeK 公司）；流式细胞仪（美国Thermo Fisher 公司）；淡附片（附子炮制品）（批号：190301）、干姜（批号：190201）（咸阳市北京同仁堂药店，经陕西中医药大学中药鉴定教研室张岗教授鉴定为正品）。

1.2 细胞种类及来源

大鼠心肌细胞株H9C2 细胞（武汉博士德生物工程有限公司，货号：CX0125）。

2 方法

2.1 干姜附子汤中候选活性化合物与靶点的收集与筛选

以附子、干姜为关键词在中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php）中检索附子、干姜的化学成分。以口服生物利用度（OB）≥30%，药物相似性（DL）≥0.18为标准[12]，获取附子、干姜主要活性化合物。考虑到化合物含量、代谢及药理作用，对附子、干姜有效化合物进行补充。附子的主要成分为生物碱，干姜的主要成分为挥发油，故加入现有研究报道的附子、干姜的主要活性成分中[13-14]。根据OB、DL 筛选完后加入deoxyaconitine、aconitine、hypaconitine、mesaconitin、6-gingerol、8-gingerol、10-gingerol、6-shogaol、zingerone 9 个化学成分。在TCMSP 和CTD（http：//ctdbase.org/）数据库中收集上述获得成分的靶点。并使用Uniport（https：//www.uniprot.org/）数据库标准化靶点名称。进而利用Cytoscape 3.8.0 绘制“干姜附子汤-活性成分-靶点”网络。

2.2 MI/RI 靶点的收集

以心肌缺血再灌注损伤为关键词在Disgenet[13]（http：//www.disgenet.org/）数据库中收集MI/RI 靶点。然后将干姜附子汤和MI/RI 的靶点导入韦恩图在线工具中获取干姜附子汤抗MI/RI 的靶点。

2.3 干姜附子汤抗MI /RI 的PPI 网络构建

将干姜附子汤抗MI/RI 的靶点导入到String（https：//string-db.org/）数据库，选择Multiple proteins 功能，以Homo sapiens 为条件，将获得的结果保存为tsv 文件格式，再将其导入Cytoscape 3.8.0，选择网络拓扑分析功能可视化结果。

2.4 GO 富集分析和KEGG 富集分析

在DAVID 数据库[15]（https：//david.ncifcrf.gov/）中选择Functional Annotation 功能，导入共同靶点后，以Homo sapiens 为筛选条件获得GO、KEGG 结果。按P＜0.05 为筛选条件，使用R语言制作气泡图。

2.5 药物制备

干姜附子汤按照方中比例（干姜∶附子＝1∶1）混合，在室温下用8 倍量体积水浸泡0.5 h，然后煎煮2 次，每次1 h。滤液通过4 层纱布收集，合并滤液并浓缩至制成含生药0.1 g·mL－1的药液离心，上清液用0.22 μm 水相微孔滤膜除菌，密封。

2.6 分组及造模

将H9C2细胞分为5组：Control 组、Model 组、干姜附子汤低剂量（0.125 mg·mL－1）、干姜附子汤中剂量（0.25 mg·mL－1）、干姜附子汤高剂量（0.5 mg·mL－1）组，除Control 组外，其余4组均参照文献造模方法[16]建立MI/RI 模型，其中给药组预处理24 h 后建立MI/RI 模型。

2.7 CCK8 法检测 H9C2 细胞存活率

将浓度为1×105个·mL－1的H9C2 大鼠心肌细胞铺板，待细胞完全贴壁后各给药组给予100 μL 含药培养液干预，且含药培养液设置空白对照孔，每个浓度设置6 个复孔，Model 组给予DMEM 完全培养基。培养24 h 后于每孔加入10 μL 的CCK8，培养箱孵育2 h 后，小心吸净原液，每孔加入100 μL 的DMSO 溶液，至结晶完全溶解后，酶标仪检测OD值，以空白对照组的吸光度均值为100%，计算其余各组细胞活性。计算公式为：

2.8 H9C2 细胞凋亡率测定

Annexin V-FITC/IP 双染法检测凋亡，将造模后的H9C2 细胞培养液吸出至2 mL 离心管内，PBS 小心冲洗后用不含EDTA 胰酶消化细胞，消化后将上述收集的培养液终止消化后转移至离心管内，离心弃上清液，后加入500 μL 结合液，5 μL Annexin V-FITC，混匀后加5 μL 碘化丙啶后在流式细胞仪检测H9C2 细胞凋亡率。

2.9 Na＋-K＋-ATP、Ca2 ＋-Mg2 ＋-ATP 酶活力测定

将按“2.6”项下分组的各组细胞，用PBS作为匀浆介质破碎后离心取上清液，按线粒体Na＋-K＋-ATP、Ca2＋-Mg2＋-ATP 酶 试剂盒操作说明，进行酶促反应、定磷，用分光光度计在660 nm 处测定吸光度值，通过磷标准曲线推算线粒 体Na＋-K＋-ATP、Ca2＋-Mg2＋-ATP酶活力，每组均采用复管测定。

2.10 统计学处理

采用SPSS 18.0 统计学软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，以α＝0.05 为检验水准。

3 结果

3.1 网络药理分析结果

3.1.1 干姜附子汤活性成分及靶点筛选 通过TCMSP 平台以及化合物补充共收集到干姜附子汤中成分16 个，其中附子7 个，干姜9 个（见表1）。获得作用靶点171 个，成分靶点网络图（见图1）。图1中三角形代表成分，圆形代表靶点。其中Degree 值排名靠前的成分为附子中的乌头碱（Degree：45），干姜中的β-谷甾醇（Degree：38），10-姜酚（Degree：26）。提示这些成分可能是干姜附子汤治疗MI/RI 的核心成分。

表1 干姜附子汤活性成分表Tab 1 Active ingredients of dried ginger-aconite decoction

图1 干姜附子汤-活性成分-靶点网络图Fig 1 Dried ginger-aconite decoction-active ingredient-target network

3.1.2 干姜附子汤抗MI/RI 靶点收集 Disgenet中获得MI/RI 靶点966 个。将干姜附子汤的靶点与MI/RI 靶点导入韦恩图（见图2）在线工具中获取干姜附子汤抗MI/RI 靶点80 个（见表2）。

图2 干姜附子汤抗MI/RI 靶点Fig 2 Anti-MI/RI targets of dried ginger-aconite decoction

3.1.3 PPI 网络图构建 将80 个共同靶点导入String 数据库进行网络拓扑分析。网络图中包含80 个节点，871 条边（见图3）。节点的大小表示度值。Degree 值排名前5 的靶点为AKT1、IL6、TNF、MAPK3、TP53。提示这些靶点可能是干姜附子汤抗MI/RI 的核心靶点。

3.1.4 干姜附子汤抗MI/RI 的GO 富集和KEGG通路分析 GO 功能富集分析得到GO 条目158 个（P＜0.05），包括生物过程条目（BP）118 个，主要涉及凋亡过程的负调控，脂多糖介导的信号通路，线粒体膜电位的调节，DNA 损伤响应的固有凋亡信号通路，缺乏配体的外在凋亡信号通路，线粒体中细胞色素C 的释放，内质网应激反应的固有凋亡信号通路。细胞组成（CC）条目22 个分子，主要涉及胞质溶胶、细胞外区域、核、膜筏、血液微粒。分子功能（MF）条目18 个涉及相同的蛋白质结合、蛋白质均二聚活性、血红素结合、蛋白质异二聚活性、过氧化物酶活性。根据P值进行排序，选择前10 进行绘图，结果见图4。

KEGG 通路富集筛选得到102 条信号通路（P＜0.05），主要涉及PI3K-Akt、TNF、HIF-1、甲状腺激素、细胞凋亡等信号通路。如图5所示，其中排序越靠前，提示越可能是干姜附子汤抗MI/RI 的机制。

3.1.5 干姜附子汤-靶点-通路网络构建与分析干姜附子汤对应的靶蛋白和通路对应的靶蛋白进行映射后得到32 个共有靶点，对应12 个有效活性成分和10 条信号通路。用Cytoscape 3.8.0 构建“干姜附子汤”治疗MI/RI“活性成分-靶点-通路”的网络药理图见图6。

3.2 细胞实验

表2 干姜附子汤抗MI/RI 靶点Tab 2 Anti-MI/RI targets of dried ginger-aconite decoction

3.2.1 细胞存活率检测结果 如表3所示，与Control 组比较，Model 组细胞存活率显著下降（P＜0.01）；与Model 组比较，干姜附子汤不同浓度作用于H9C2 细胞存活率显著增加（P＜0.01），且对H9C2细胞有促增殖作用，在预给药浓度为0.25 mg·mL－1时，存活率最高。

3.2.2 细胞凋亡检测结果 如图7心肌细胞凋亡检测结果显示，与Control 组比较，Model 组细胞凋亡显著增加（P＜0.01）；与Model 组比较，各给药组细胞凋亡显著减少（P＜0.01），且当干姜附子汤浓度为0.25 mg·mL－1时，细胞凋亡率最低。

3.2.3 Na＋-K＋-ATP、Ca2＋-Mg2＋-ATP 酶活性检测结果 如表4所示，与Control 组比较，Model 组细胞Na＋-K＋-ATP、Ca2＋-Mg2＋-ATP 酶活力显著降低（P＜0.01）；与Model 组比较，各给药组Na＋-K＋-ATP、Ca2＋-Mg2＋-ATP 活力均升高（P＜0.01）。

图3 干姜附子汤抗MI/RI 共同靶点PPI 网络图Fig 3 PPI network of anti-MI/RI common targets of dried ginger-aconite decoction

图4 预测靶点的GO 富集分析Fig 4 GO enrichment analysis of predicted targets

图5 预测靶点的KEGG 富集分析Fig 5 KEGG enrichment analysis of predicted targets

表3 干姜附子汤对H9C2 细胞存活率的影响(x±s，n ＝6)Tab 3 Effect of dried ginger-aconite decoction on the survival rate of H9C2 cells (x ±s，n ＝6)

表4 干姜附子汤对H9C2 细胞MI/RI 损伤后Na＋-K＋-ATP、Ca2 ＋-Mg2 ＋-ATP 酶活性的影响(x±s，n ＝6)Tab 4 Effect of dried ginger-aconite decoction on Na＋-K＋-ATPase and Ca2＋-Mg2＋-ATPase after MI/RI injury in H9C2 cells (x± s，n＝6)

4 讨论

图6 干姜附子汤成分-靶点-通路图Fig 6 Composition-target-pathway diagram of dried ginger-aconite decoction

图7 干姜附子汤对H9C2 细胞MI/RI 损伤后凋亡的影响Fig 7 Effect of dried ginger-aconite decoction on the apoptosis of H9C2 cells after MI/RI injury

在心血管疾病中，缺血性心脏病是致死致残的主要原因，通常与急性冠状动脉阻塞有关。临床上的常见治疗策略是通过溶栓或主要经皮冠状动脉介入治疗对缺血区域进行早期再灌注，尽管对挽救受损的心肌有效，但仍可能导致进一步的损伤，例如心肌震颤、心律不齐和心肌细胞死亡等[17]。因此，为了改善急性心肌梗死的临床结局，探索MI/RI 安全有效的治疗干预措施至关重要。

本研究运用网络药理学的方法筛选出干姜附子汤的活性成分16 个，预测出其治疗MI/RI 的靶点80 个，网络图提示乌头碱、β-谷甾醇、10-姜 酚、AKT1、IL6、TNF、MAPK3、TP53可 能是干姜附子汤治疗MI/RI 的核心有效化合物和靶点。GO 富集分析提示干姜附子汤抗MI/RI 主要与凋亡过程的负调控，缺乏配体的外在凋亡信号通路，线粒体膜电位的调节，DNA 损伤响应的固有凋亡信号通路，脂多糖介导的信号通路有关，这些生物过程大多与细胞凋亡有关。KEGG 富集分析提示干姜附子汤可能通过PI3K-Akt、TNF、HIF-1、甲状腺激素、细胞凋亡等信号通路治疗MI/RI。其中细胞调亡、PI3K-Akt、HIF-1 等信号通路均与心肌细胞凋亡有关[18-19]。研究表明，抑制心肌细胞凋亡是治疗MI/RI 的一种策略[20-25]。综上，结合网络药理学的预测和先前的研究，本研究拟从细胞凋亡的角度出发，验证网络药理学预测干姜附子汤治疗MI/RI 的机制。

线粒体不仅是细胞内合成ATP 的场所，也是细胞凋亡的控制中心。由于心脏的高能量需求，心肌组织中含有较多的线粒体[26]。线粒体内膜上含有大量的Na＋-K＋-ATP 酶和Ca2＋-Mg2＋-ATP酶，这些酶可以维持细胞膜电位，催化ATP 分解成ADP 并释放能量[27]。当心肌缺血缺氧时，ATP 产生减少，Na＋-K＋-ATP、Ca2＋-Mg2＋-ATP酶活性降低，线粒体内Ca2＋超载，氧自由基大量生成，线粒体膜膜电位发生改变，最终导致细胞凋亡[28]。徐炜棉等[29]研究表明苦参碱可提高阿霉素损伤的H9C2 心肌细胞Na＋-K＋-ATP酶、Ca2＋-ATP 酶活性并减少H9C2 心肌细胞凋亡。霍礼超等[30]研究表明运动可提高胰岛素抵抗大鼠Na＋-K＋-ATP 酶活性，胸腺细胞凋亡减少。曾先燕等[31]研究结果提示橙皮素可提高MI/RI 损伤的H9C2 心肌细胞中Ca2＋-Mg2＋-ATP 酶活性，并减少心肌细胞凋亡。本研究发现干姜附子汤可显著提高MI/RI 损伤的H9C2 心肌细胞中的Na＋-K＋-ATP、Ca2＋-Mg2＋-ATP 酶活性并减少H9C2 细胞凋亡率，与文献结果一致。

综上，干姜附子汤对心肌细胞MI/RI 损伤具有保护作用，其作用机制可能与改善心肌细胞能量代谢及减少心肌细胞凋亡有关，但其具体作用机制有待进一步研究。