电解质诱导胶原在云母基底上的类外延附生有序聚集

魏香奕，代娟，袁亚，孙警辉，李学理，刘玲玲＊

（1.成都医学院四川省动物源性食品兽药残留防控技术工程实验室，四川成都610500；2.成都医学院检验医学院，四川成都610500）

1 前言

胶原是许多动物组织细胞间质的重要结构组分，与此同时，胶原分子的超分子聚集模型是生物大分子研究领域的一个代表性模型，对于模拟组织生长过程、人工生物材料和制备生物相容性界面等都有重要的基础研究价值。

云母是一种极完全解理矿物，新剥离的优质云母表面具有原子级的平整度，因此它是一种理想的基底材料，特别适用于原子力显微镜（atomic force microscope,AFM）这种测量纳米尺度微观形貌的检测手段。因此在检测精度小于微米级时，通常使用云母片作为制样的基底材料[1,2]。然而由于云母表面带电荷，蛋白质等样品在云母表面的吸附行为不可避免地要受到影响。一些研究发现，胶原分子在云母片上能够形成有取向性的聚集结构，这些结构和云母的晶格排列密切相关，可能是一种“类外延附生”现象[3]。

“类外延附生”现象被认为是制备功能性纳米材料的潜在手段，许多分子量较小的生物分子在无机矿物表面的外延附生现象被观察到[4,5]，但这些蛋白质分子和无机基质表面的作用力较弱，其附生结构不易严格按照基质的晶格走向生长。对于像胶原这样的生物大分子，其分子量较大，外延附生现象更难以获得。此外，由于纳米尺度的界面行为主要是由一些分子间弱相互作用力驱动，因此受各种物化环境影响较大，且辅助的检测手段也很少，因此对生物大分子在无机基质表面外延附生现象的研究主要集中在现象观察上，例如通过调节某些物化条件，观测外延附生结构的变化[6,7]，但从机理上解释生物大分子在无机基质表面外延附生现象的研究相对缺乏[8,9]。

近期的研究表明，电解质可能在生物大分子的外延附生聚集过程中扮演了重要的角色[10,11]。本文通过研究电解质浓度、电解质种类对胶原在白云母基底上的类外延附生现象，并结合胶原溶液在一定电解质环境中的表面电位变化，尝试阐明类外延附生过程中胶原-电解质-无机质基底之间的交互作用，以期对生物大分子有序聚集行为在生物工程材料、生物传感器以及纳米科技等领域的应用提供基础数据。

2 实验部分

2.1 主要实验仪器和材料

2.1.1 主要实验仪器

原子力显微镜SPM-9600，日本岛津公司；NSG-11 型镀金硅探针（轻敲模式用），弹性系数5.5～22.5 N/m， 俄 罗 斯 NT-MDT 公 司；OMCL-TR800PSA 氮化硅探针（接触模式用），美国Olympus 公司；生化培养箱LRH-250，上海齐欣科学仪器有限公司；精密酸度计PHC-3C，上海雷磁公司；激光粒度仪Zetasizer Nano ZS90，英国马尔文公司。

2.1.2 主要实验材料

I 型胶原储备溶液（3 mg/mL），自制；云母片，日本岛津公司提供；KCl，NaCl，K2SO4等无机盐均为分析纯，购于成都科龙化工试剂厂。

2.2 实验方法

2.2.1 KCl 浓度对胶原在云母基底上聚集的影响

配制pH 为4.2 的醋酸-醋酸钠缓冲液，醋酸浓度约0.02 mol/L，并用其稀释胶原储备液，得到质量浓度为100 μg/mL 的胶原溶液，待用。同时用醋酸-醋酸钠缓冲液配制1 mol/L 的KCl 溶液。向胶原溶液中加入一定量的KCl 溶液和醋酸-醋酸钠缓冲液，使混合体系的最终胶原质量浓度为10 μg/mL，KCl 浓度分别为0、0.05、0.1、0.35 mol/L。用漩涡震荡仪将混合体系充分混合并平衡30 min 后，用微量移液枪取25 μL 的混合溶液滴于新剥离的云母片上，吸附15 min 后，用蒸馏水将表面多余的胶原溶液轻轻冲走，并吸干多余残液。

样品置于洁净操作台内室温条件下自然干燥12 h，并于干燥器内放置12 h，得到用于原子力显微镜检测的样品。使用岛津SPM-9600 原子力显微镜检测样品，原子力显微镜带有气床缓冲附件减小测试噪音。使用岛津SPM-9600 附带软件进行快速傅里叶转换（fast Fourier transform,FFT）处理。

2.2.2 KCl 浓度对胶原溶液zeta 电位的影响

采用论文2.2.1 的方法，用pH 为4.2 的醋酸-醋酸钠缓冲液配制胶原质量浓度为40 μg/mL，KCl 浓度分别为0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.12、0.15 mol/L 的混合溶液。用漩涡震荡仪将混合体系充分混合，平衡30 min 后，用激光粒度仪测量胶原溶液的zeta 电位。

2.2.3 电解质类型对胶原在云母基底上聚集的影响

采用论文2.2.1 的方法，用pH 为4.2 的醋酸-醋酸钠缓冲液配制一系列胶原质量浓度为10 μg/mL，K2SO4，(NH4)2SO4，NaCl，KNO3浓度不同的混合溶液，制备用于AFM 观测的样品，并使用轻敲模式观测。

2.2.4 电解质类型与浓度对胶原溶液zeta 电位的影响

采用论文2.2.1 的方法，配制胶原质量浓度为40 μg/mL，中性盐浓度分别为0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.12、0.15、0.02、0.25 mol/L 的混合溶液。用漩涡震荡仪将混合体系充分混合，平衡30 min 后，测量胶原溶液的zeta 电位。

3 结果与讨论

3.1 胶原在云母基底上的类外延附生现象

图1 KCl 对胶原在云母基底上聚集的影响a)对照样；b)0.35 mol/L（pH 4.2,胶原浓度10 μg/mL）Fig.1 Effect of KCl on the assembly of collagen on mica substratea)control；b)0.35 mol/L(pH 4.2,collagen concentration:10 μg/mL)

图2 胶原在云母表面上形成的有序聚集结构的方向特征Fig. 2 Directional characteristics of the collagen assembly structures deposited on mica surface

在无KCl 作用时，胶原于云母表面上形成了一层致密的膜，如图1a 所示，这表明胶原在云母表面未发生聚集。当KCl 浓度为0.35 mol/L 时，具有方向性的胶原聚集纤维清晰可见，如图1b 所示。

由图1 和2 可以看出，胶原在云母表面上形成的纤维状聚集结构，主要集中在两个方向，如图1b、图2a、图2b 所示，初步观察两个方向间夹角约为60°。为了进一步采集胶原的纤维状聚集结构的取向信息，我们使用快速傅立叶转换工具对图像进行处理，图2a 右上角的插图为图像处理后得到的二维快速傅立叶转换过滤图像，更清晰的表明了两个方向之间的60°夹角。

实验所得的胶原聚集结构，其方向特征和云母（001）表面的晶体学方向是基本一致的。图2b 右上角插图即为AFM 接触模式高分辨率扫描云母基底，并使用快速傅立叶转换的周期信息校正处理后的云母基底图像；图2c 为云母的晶格走向示意图。这表明，胶原分子在云母表面的有序聚集，与云母表面晶体结构密切相关，即外延附生现象。值得注意的是，对于那些小的生物分子在云母表面上的外延附生，有序聚集结构一般能严格的和云母表面的六边形结构吻合，即按照三个互为60°夹角的方向聚集。但是对于胶原这种分子量较大的生物分子，聚集结构可能和云母的晶体结构不能完全吻合，因此本实验中能清晰观察到两个主导的聚集方向，第三个方向不太明显。研究结果初步表明，KCl 的存在对胶原在云母表面上的有序聚集十分关键。

3.2 KCl 浓度对胶原类外延附生的影响及对应的zeta 电位分析

图3 KCl 浓度对胶原在云母基底上聚集的影响a)0 mol/L；b)0.05 mol/L；c)0.1 mol/L；d)0.35 mol/L（pH 4.2,10 μg/mL 胶原）Fig. 3 Effect of KCl concentration on the collagen assembly on mica substratea)0 mol/L；b)0.05 mol/L；c)0.1 mol/L；d)0.35 mol/L(pH 4.2,10 μg/mL collagen)

为了进一步了解KCl 对这种类外延附生的影响，我们研究了不同KCl 浓度下胶原在云母表面的聚集行为，结果见图3。当未加入KCl 的时候，胶原分子无序的吸附在云母表面上，分子间几乎没有产生聚集（图3a）。KCl 浓度为0.05 mol/L 的时候，胶原分子产生一定程度的聚集，纤维变长变粗，并在云母片上形成了网状结构，但是方向上仍是杂乱无序（图3b）。当KCl 浓度为0.1 mol/L 时，胶原分子的聚集结构产生了一定的方向性，但仍然稍显杂乱（图3 c）。当KCl 浓度为0.35 mol/L 时，胶原束在云母片上的有序排列更为清晰，胶原束聚集更为紧密（图3d）。当KCl 浓度进一步增大，可能是由于胶原分子聚集过度，在蒸馏水流冲洗后很难继续吸附在云母表面上。

以上结果表明，KCl 的加入促进了胶原在云母表面上的类外延附生聚集。在一定的KCl 浓度范围，类外延附生聚集结构随着KCl 浓度的增大而变得明显。有文献曾对生物分子在云母或其他无机表面上的类外延附生机理进行研究，但由于缺乏有效的辅助研究手段，对于机理的研究仍不充分[11-13]。Richard W. Loo 等认为钾离子是胶原在云母基底上形成取向性聚集结构的关键所在[11]；Tomoyuki Akutagawa 等认为钾离子是电荷转移络合物在云母基底上外延附生的主要条件[14]；Klemen Kunstelj 等认为云母基底上固有的钾离子对鸟苷酸的外延附生有关键作用，大于溶液中引入的钾离子对其的贡献[15]。这些研究的结论都认为钾离子可能是这些生物分子外延附生现象的关键因素，然而由于辅助研究手段的缺乏，这些结论都缺少更进一步的数据支持和理论分析[16]。

新剥离的云母其解理面同时具有正电荷带和负电荷带，活性氧原子层形成了负电带，随着云母晶层剥离而部分缺失的钾原子形成了正电带，两种电荷带以几个大小的周期交替出现，这是分子在其表面进行外延附生的晶体学基础。然而由前面的实验结果可以看出，胶原在云母基底上形成的取向性聚集结构其尺度为数百纳米，比云母晶格尺度大几千倍[3,17]。经初步分析，氨基酸残基和云母表层的原子也不太可能产生特殊的定点结合。综上所述，胶原在云母基底上的外延附生更可能是受一些微小区域的分子间弱相互作用力推动，这些弱作用力通过放大、总和从而产生纳米尺度的外延附生现象。考虑到云母解理面上的周期性正负带，我们认为静电作用力可能是胶原在云母基底上外延附生现象的主要推动力之一。作为胶原- 云母基底交互作用而产生的外延附生现象，其静电作用力是来自胶原和云母两者的交互作用。因此，尝试表征KCl 存在时胶原溶液的zeta 电位，来获得其表面电荷信息，进而分析静电作用力对胶原在云母基底上类外延附生的贡献。

实验用胶原是通过胃蛋白酶水解牛皮制得，前期实验测定其等电点在6.8 附近，为了保持胶原溶液的分散稳定性，一直用缓冲液将胶原溶液体系的pH 值控制在4.2 附近，此时胶原溶液的zeta电位为正，这意味着胶原分子表面滑动面电位为正[18]。

加入电解质能使胶原溶液的zeta 电位符号发生改变，如图4 所示（折线图使用B 样条曲线拟合）。随着KCl 浓度的增大，胶原溶液的zeta 电位值逐渐减小趋于0，并在0.1 mol/L 附近发生了表面电荷反转，zeta 电位的符号由正变负。结合图3中的胶原聚集结构图像来看，我们发现也是在KCl浓度增大到0.1 mol/L 之后，胶原聚集结构开始呈现有序性，并在KCl 浓度0.35 mol/L 时，出现明显的类外延附生现象。但是由于KCl 浓度的继续升高，导致溶液中胶原聚集加剧，相分离严重，使激光粒度仪的测量精度下降、数据波动增大，无法采用。通过计算平行样的标准差，认为KCl 浓度大于0.15 mol/L 时便超出了论文测量方法检出范围，zeta 数据曲线采用。

3.3 电解质类型对胶原类外延附生的影响及对应的zeta 电位分析

图4 KCl 浓度对胶原溶液zeta 电位的影响Fig. 4 Effect of KCl concentration on the zeta potential of collagen solution

如前所述，许多文献认为钾离子在类外延附生过程中非常关键，但是这些生物分子与钾离子并无特殊反应位点，同时，论文3.2 中实验结果表明了zeta 电位符号改变与胶原类外延附生现象的相关性。基于以上结论我们推测，除钾离子外，还有其他无机盐离子亦能使胶原溶液的zeta 电位符号改变，进而同样能诱导外延附生现象。为了验证此推论，我们使用了含有K+，NH4+，Na+，SO42-，Cl-，NO3-等其他无机电解质开展了进一步的研究。

图5 两种电解质对胶原在云母基底上聚集形貌和zeta 电位a:0.15 mol/L K2SO4；b:0.35 mol/L(NH4)2SO4Fig. 5 Effects of two electrolytes on the assembly morphology of collagen on mica substrate and its zeta potentiala:0.15 mol/L K2SO4；b:0.35 mol/L(NH4)2SO4

图6 两种电解质对胶原在云母基底上聚集形貌和胶原溶液zeta 电位的影响a:0.35 mol/L NaCl；b:0.35 mol/L KNO3Fig. 6 Effects of two electrolytes on the morphology of collagen on mica substrate and its zeta potentiala:0.35 mol/L NaCl；b:0.35 mol/L KNO3

如图5 所示，在一定浓度K2SO4和(NH4)2SO4的诱导下，胶原同样发生了外延附生现象，其形貌与KCl 诱导的胶原纤维相似。(NH4)2SO4诱导实验证明，并非只有K+才能诱导胶原在云母基底上发生外延附生聚集。同时zeta 电位数据表明，随着K2SO4和(NH4)2SO4浓度的增大，胶原溶液的zeta 电位符号同样发生了从正到负的转变。实验结果表明，胶原在云母基底上发生外延附生聚集的必要条件，可能不是钾离子，而是钾盐导致的溶液中胶原分子表面电荷符号的反转。

与此同时，如图6 所示，在NaCl 和KNO3的诱导下，胶原在云母基底上的聚集结构却仍然无序，而其zeta 电位符号也未发生转变，一直在正值区间。实验结果进一步验证了推论，即电解质诱导的zeta 电位符号反转，对胶原在云母基底上的类外延附生现象可能起到关键作用。

云母属于单斜晶系，具有两层六方网层夹一层八面体层的三层结构层，称为云母结构层。六方网层中四分之一的Si 为Al 所代替，使结构层内有剩余电荷，因而由较大的阳离子K+充填于结构层之间，以维持电荷平衡。当云母沿着其[001]晶面被剥离时，两层之间的钾离子发生了一定缺失，使云母表面略带负电[17]。

结合云母的晶体结构，作出以下推论：当胶原溶液zeta 电位为正时，胶原分子的滑动面电位为正，与带负电的云母表面产生较强的静电作用力，吸附速度较快，分布随机，形成杂乱无序的排布。而当胶原溶液zeta 电位为负时，胶原分子的滑动面电位为负，胶原分子和云母表面带负电的活性氧原子发生静电排斥，吸附过程较缓慢，吸附过程中胶原分子与云母表面带正电的钾原子相互吸引，双重作用力推动胶原分子在云母表面形成有取向的排列。胶原分子电荷为负，一方面减缓了静电作用力导致的吸附，使胶原得到取向性聚集的时间；另一方面，云母表面带正电荷的钾原子，其排布间距远大于活性氧原子晶格带的间距，有利于胶原这类生物大分子的类外延附生。

4 结论

在KCl 诱导下，胶原分子能在云母基底上发生类外延附生聚集，形成具有一定取向性的规律排布，其方向性受到云母晶格的影响。KCl 的浓度明显影响类外延附生过程，随着KCl 浓度的增大，胶原在云母上的聚集结构从无序变有序。约在KCl浓度0.1 mol/L 时，胶原溶液的zeta 电位符号从正变负，同时胶原产生了取向性，说明胶原溶液zeta电位符号变化和胶原类外延附生现象有关联。其他电解质实验表明，K2SO4和(NH4)2SO4能使胶原溶液的zeta 电位符号从正变负，也能使胶原产生外延附生现象；NaCl 和KNO3未能使胶原溶液的zeta电位符号从正变负，也未能使胶原产生外延附生现象。

综上所述，电解质诱导胶原溶液zeta 电位符号由正到负的转变可能是胶原在云母基底上产生类外延附生聚集的重要因素。