盐碱胁迫对4种杜鹃属植物种子萌发和幼苗生长的影响

刘 攀，耿兴敏*，宦智群，李 畅，苏家乐

(1.南京林业大学 风景园林学院，江苏 南京 210037；2.江苏省农业科学院 园艺研究所，江苏 南京 210014)

杜鹃属(Rhododendron)植物被誉为“花中西施”，其花期长，花色绚丽多彩，是优良的园林观赏木本植物，被广泛应用于国内外的城乡园林绿化中。杜鹃花喜酸性疏松土壤，不耐盐碱[1]。盐碱化已严重威胁环境，目前全球盐碱化土地面积约有9.5×108hm2[2]，我国盐碱土地面积达108hm2，主要分布在东北松嫩平原、西北干旱地区、华北平原以及沿海地区[3]，严重限制了杜鹃花在这些地区园林绿化中的推广应用。

土壤盐和碱是限制植物生长的重要因素[2,4]，对植物的种子萌发、生长发育都会造成不同程度的影响[3]，会造成发芽延迟、幼苗死亡率高和植物生长不良[5]。通常盐胁迫与高浓度的离子有关，主要以NaCl和NaSO4的形式存在，可破坏植物的离子稳态和平衡，引起渗透胁迫和离子超载，而碱盐胁迫以NaHCO3和Na2CO3为主，其影响主要与高盐、高pH值及其相互作用有关[6]。盐碱胁迫下由于种子萌发介质的渗透压较低，改变了种子自吸水分的特性，减少种子储备的利用[7]，影响分裂细胞，降低植物生长率[8]，导致植物生长不良或死亡。

目前对于杜鹃属植物非生物胁迫的研究主要集中在高温[9-10]、低温[11-12]、干旱[13-14]等方面，而对于盐碱胁迫的关注相对较少。过多的Na+和高pH值是盐碱地上植物生长的主要限制因子[15]。目前盐碱胁迫对种子影响的研究主要集中在中性盐NaCl胁迫[16-17]，对于碱胁迫研究也多集中在探讨杜鹃适宜的pH值[18-19]，而碱性盐Na2CO3、NaHCO3对杜鹃种子萌发的研究尚未见报道。明确植物种子萌发阶段及幼苗生长期对逆境胁迫的适应性非常重要[7]，部分植物早期对盐碱胁迫逆境适应性不良，会严重影响植物的栽培繁殖及推广应用。因此本研究以4种杜鹃属植物：马银花(R.ovatum)、满山红(R.mariesii)、映山红(R.simsii)和云锦杜鹃(R.fortunei)的种子为试验材料，研究不同浓度盐碱处理下种子的萌发和幼苗生长情况，旨在确定4种杜鹃属植物的耐盐碱范围，筛选耐盐碱种质，为后期的耐盐碱杜鹃花新品种选育和应用研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料为4种杜鹃属植物的种子，其中马银花、满山红和映山红的种子(2017年10月)采自南京市玄武湖情侣园，云锦杜鹃种子(2017年11月)采自浙江九龙山。种子收集后25℃烘箱连续烘干2 d，烘干后筛出种子，置于4℃ 冰箱保存，直至2018年3月用于播种试验。

1.2 试验方法

1.2.1 播种期的盐碱胁迫处理

将种子灭菌后，接种到相应处理的WPM培养基上。盐(NaCl)处理浓度设为0、50、100、150 mmol/L(pH 5.20)，碱(NaHCO3，考虑到杜鹃为酸性土植物和Na2CO3的强碱性，试验选择弱碱性的碱性盐NaHCO3)胁迫处理浓度为0、15、30、60 mmol/L(pH值分别为5.20、7.70、8.04、8.25)。每处理接种3个培养皿，每个培养皿接种100粒，重复3次。培养条件：温度 25±2℃，光照强度65 μmol·m-2·s-1左右，光照时数14 h/d。统计发芽率、发芽势、发芽指数，每24 h观察记录种子发芽情况，连续3 d种子萌发率不超过1%视为萌发结束。试验重复3次。

1.2.2 幼苗期的盐碱胁迫处理

分2种方法对杜鹃幼苗进行盐碱处理，第一种为1.2.1中盐碱发芽试验的幼苗，种子萌发60 d后，每处理选取10株苗，测定出苗率(2片子叶出土)和叶片数，用直尺准确测量株高(基质表面至生长点的长度)和根长(基质表面至主根的生长点的长度)。第二种取无盐碱处理苗龄为4个月的生长一致的组培苗，分别移植于不同盐碱处理的WPM培养基上。盐胁迫处理为：0、100、150 mmol/L(pH 5.20)NaCl溶液，碱胁迫处理为：0、7.5、10 mmol/L NaHCO3溶液。每个处理接种8瓶苗，每瓶4棵苗。

盐胁迫15 d后，碱胁迫10 d，对植株盐/碱害表型分级。参照刘婉迪等[10]的方法稍作改变计算叶片褐变指数，将叶片的褐变状态分为6级，0级：绿色，未褐变；1级：轻度褐变，叶片边缘褐化；2级：中度褐变，叶片带有轻微的斑点，1/3部分褐变；3级：中度褐变，叶片1/2部分褐变；4级：重度褐变，叶片2/3部分褐变；5级：枯萎，叶片全部褐变或脱落。

1.3 指标统计及数据处理

相关指标统计方法：发芽率=种子发芽总数/供试种子总数(100粒)×100%；发芽势=达到高峰时发芽种子数/参试种子总数(100粒)×100%；发芽指数GI=Σ(Gt/Dt)(Gt为5 d内的发芽数，Dt为相应的发芽天数)；盐/碱害指数(%)=(对照组萌发率-盐/碱处理萌发率)/对照组萌发率×100%。出苗率(%)=出苗数/种子萌发数×100%；褐变指数=[∑(褐变级值×相应褐变级值叶片数)/(总叶片数×褐变最高级值)×100 %]。

用 SPSS19.0软件计算杜鹃属种子的盐碱半致死浓度(LC50)[20]，对不同盐碱胁迫处理间进行单因素方差分析，用Duncan法对平均值进行多重比较，实验数据表示为平均值±标准差。

2 结果与分析

2.1 不同盐浓度对杜鹃种子萌发及幼苗生长的影响

2.1.1 不同盐浓度对种子萌发的影响

从表1可看出，随着盐浓度的升高，4种杜鹃属植物的种子萌发率、发芽势、发芽指数呈显著下降趋势，当盐浓度达到150 mmol/L时，种子萌发率、发芽势、发芽指数达到最低。所有盐处理的种子萌发率都低于对照组，可见盐胁迫明显抑制了种子的萌发。盐胁迫对不同种杜鹃的影响存在差异，在轻度(50 mmol/L)盐胁迫下，云锦杜鹃的种子萌发率与对照相比无显著差异(P>0.05)，而其它3种发芽率显著下降(P<0.05)；当盐浓度为100 mmol/L时，云锦杜鹃的发芽率在4种杜鹃属植物中最高，映山红次之，马银花发芽率为26.33%，满山红发芽率最低，仅为15.33%。杜鹃对盐胁迫的响应具有种间差异，在同一浓度盐胁迫下，云锦杜鹃的发芽率、发芽势和发芽指数显著高于其它3个杜鹃种。随着盐胁迫浓度加大，4种杜鹃的盐害指数加大，当盐浓度为50 mmol/L时，云锦杜鹃的相对盐害率最低，仅为4.91%，马银花、满山红和映山红的盐害指数较大，三者相差不大；当盐浓度达到100 mmol/L，马银花和满山红的盐害指数急剧增加，分别为64.55%和74.16%，映山红的盐害指数居中，云锦杜鹃的盐害指数最小，仅为14.29%；当盐浓度达到150 mmol/L时，马银花、满山红和映山红的盐害指数达到最大，而云锦杜鹃的盐害指数低于其它3个种，为65.63%。结果表明盐胁迫抑制了杜鹃种子萌发，4种杜鹃中云锦杜鹃的耐盐性较好，马银花和满山红耐盐性最差。

表1 不同盐浓度对杜鹃种子萌发的影响Table 1 Effects of different salt concentrations on seed germination of four Rhododendron species

2.1.2 杜鹃萌发期盐碱半致死浓度的确定

从表2可看出，4种杜鹃的盐半致死浓度从高到低依次为：云锦杜鹃>映山红>马银花>满山红。4种杜鹃的适宜浓度与盐半致死浓度稍有差异，范围在28.95～51.29 mmol/L，从高到低依次为：云锦杜鹃>马银花>映山红>满山红。从相关系数来看，4种杜鹃相关系数绝对值排序为：马银花>映山红>满山红>云锦杜鹃，综上云锦杜鹃的盐半致死浓度和适宜浓度最高，且相关系数绝对值最小，说明盐胁迫对云锦杜鹃的影响较小，云锦杜鹃的耐盐性最强。

表2 盐处理后不同种杜鹃的半致死浓度、适宜浓度及相关系数Table 2 Median lethal concentration,suitable concentration and correlation coefficient of different Rhododendron species in different salt concentrations

2.1.3 盐胁迫对杜鹃幼苗生长的影响

播种60d后，4种杜鹃属植物的出苗率、平均叶片数、株高、根长和根/茎比都随着盐胁迫浓度的增加呈现下降趋势，在50 mmol/L 盐胁迫下，马银花出苗率与对照相比显著下降，在4种杜鹃中出苗率最低，降幅达到44.06%，而满山红、映山红和云锦杜鹃的出苗率虽有下降，但不显著。马银花和满山红的根长与对照相比降幅较大。当盐浓度上升至100 mmol/L 时，4种杜鹃的出苗率显著下降，云锦杜鹃的出苗率最高，降幅最小，满山红出苗率的降幅最大，下降至63.18%，而马银花的出苗率最低，其在50 mmol/L时出苗率大幅度下降，因此在100 mmol/L时降幅不大，为40.76%；从平均叶片数来看，云锦杜鹃和映山红的平均叶片数高于马银花和满山红；马银花和满山红幼苗存在不生根现象。而当盐胁迫上升至150 mmol/L时，云锦杜鹃和映山红仍保持着较高的出苗率，马银花出苗率最低；映山红出现不生根现象。比较4种杜鹃种间数据发现，云锦杜鹃在胁迫下的出苗率、平均叶片数、根、茎生长量显著高于其它3个种。综上，四种杜鹃的耐盐性从高到低依次为：云锦杜鹃>映山红>马银花>满山红。

将幼苗进行不同浓度的盐胁迫处理，4种杜鹃的褐化率随着盐胁迫浓度的增加呈显著上升趋势。比较50 mmol/L和100 mmol/L下4种杜鹃属植物的褐化率，从高到低依次为：马银花>满山红>映山红>云锦杜鹃，云锦杜鹃褐化率显著低于其它3个种。当盐胁迫浓度为上升至150 mmol/L时，4种杜鹃属植物的褐化率均达到最大，其中马银花和满山红褐化率最高，映山红的褐化率也达到92.07%，而云锦杜鹃的褐化率较小，达到82.83%，云锦杜鹃的褐化率显著低于其它3个种。结果表明盐处理抑制了杜鹃幼苗的生长，杜鹃的幼苗生长存在种间差异，幼苗期4种杜鹃耐盐性从高到低依次为：云锦杜鹃>映山红>满山红>马银花。

表3 不同盐浓度对杜鹃幼苗生长的影响Table 3 Influence of different salt concentrations on the seedling growth of Rhododendron

表4 4种杜鹃不同盐胁迫下的褐化率Table 4 Browning rate of 4 Rhododendron species under different salt concentrations (%)

2.2 不同碱浓度对杜鹃种子萌发及幼苗生长的影响

2.2.1 不同碱浓度对种子萌发的影响

从表5可看出，随着NaHCO3浓度的增加，4种杜鹃的发芽率、发芽势、发芽指数呈下降趋势，在低浓度(15 mmol/L)胁迫下，云锦杜鹃的发芽率、发芽势与对照相比无显著差异，发芽指数显著下降，发芽率、发芽势、发芽指数在4种杜鹃中最高，其它3种杜鹃发芽率、发芽势和萌发指数显著下降，其中映山红发芽率、发芽势和发芽指数仅次于云锦杜鹃，马银花和满山红发芽率、发芽势和发芽指数降幅较大，二者萌发率较低，马银花的发芽势和发芽指数最低。碱浓度为30 mmol/L时，云锦杜鹃的发芽率显著下降，但仍显著高于其它3个种，映山红次之，满山红和马银花的发芽率较低。当碱浓度为60 mmol/L时，云锦杜鹃萌发率最高，马银花和满山红次之，映山红的发芽率最低。比较同胁迫下4种杜鹃花发现，云锦杜鹃的发芽率、发芽势和发芽指数显著高于其它3个种。随着碱胁迫浓度的增大，4种杜鹃的碱害指数增加，同一碱浓度胁迫下，云锦杜鹃碱害指数偏低，映山红和满山红居中，马银花的碱害指数最高，在碱浓度为15 mmol/L时碱害指数已高达60.45%。结果表明，碱胁迫抑制了杜鹃种子萌发，4种杜鹃中云锦杜鹃的耐碱性较好，马银花和满山红耐盐性较差。

表5 不同碱浓度对杜鹃种子萌发的影响Table 5 Effects of different alkali concentrations on seed germination of Rhododendron

2.2.2 杜鹃萌发期碱半致死浓度的确定

从表6可知，4种杜鹃属植物的碱半致死浓度从高到低依次为：云锦杜鹃>映山红>满山红>马银花，4种杜鹃的碱适宜浓度与半致死浓度排序一致，浓度范围为3.32～17.30 mmol/L。从相关系数来看，4种杜鹃相关系数绝对值排序为：满山红>映山红>云锦杜鹃>马银花。综上，云锦杜鹃的碱半致死浓度和适宜浓度最高，说明碱胁迫对云锦杜鹃的影响较小，云锦杜鹃的耐碱性最强。

表6 碱处理后不同种杜鹃的半致死浓度、适宜浓度及相关系数Table 6 Median lethal concentration,suitable concentration and correlation coefficient of different Rhododendron species in different alkali concentrations

2.2.3 碱胁迫对杜鹃幼苗生长的影响

在15 mmol/L碱处理浓度下，马银花和满山红幼苗已全部死亡；云锦杜鹃出苗率仍高达90.36%，株高与对照相比有所下降，但不显著；映山红出苗率和平均叶片数降幅较大，出苗率仅为35.09%，根长、株高和根/茎比显著下降，映山红未生根。当碱浓度上升至30 mmol/L时，云锦杜鹃和映山红出苗率、根长、株高和根/茎比显著下降；映山红出苗率仅为21.64%，远低于云锦杜鹃的出苗率(56.43%)，映山红的平均叶片数也低于云锦杜鹃，在胁迫下未生根。在60 mmol/L碱处理浓度下，映山红和云锦杜鹃幼苗也全部死亡。这说明碱处理抑制了4种杜鹃属植物幼苗的生长，幼苗生长存在显著种间差异，4种杜鹃幼苗耐碱性从高到低依次为：云锦杜鹃>映山红>马银花和满山红，云锦杜鹃在碱胁迫下的出苗率、叶片数根长、株高以及根/茎比显著高于其它3个种。

从表8可看出，幼苗随着碱胁迫浓度的增加，褐化率显著提高，在7.5 mmol/L碱胁迫下，马银花和满山红的褐化率分别达到94.11%和93.68%，显著高于云锦杜鹃和映山红，映山红褐化率居中，也达到85.78%，显著高于云锦杜鹃，而云锦杜鹃的褐化率最低，仅达到48.49%。当碱浓度达到10 mmol/L时，马银花、满山红和映山红幼苗全部褐化，而云锦杜鹃褐化率为85.44%，未全部褐化。

表7 不同碱浓度对杜鹃幼苗生长的影响Table 7 Effects of different alkali concentrations on the growth of Rhododendron seedlings

表8 4种杜鹃不同碱胁迫下的褐化率Table 8 Browning rate of 4 Rhododendron species in different alkali concentrations (%)

3 讨论与结论

3.1 盐碱胁迫对杜鹃种子萌发的影响

种子萌发能力和幼苗长势是植物耐盐碱性早期鉴定及耐盐碱个体、品种早期选择的基础[21]。在本试验中，盐、碱胁迫与杜鹃种子萌发和活力呈负相关，高盐、高碱对种子萌发的抑制作用更显著，主要表现在发芽势、发芽指数显著下降且降幅大，可能与离子失衡、渗透调节紊乱和种子吸水率下降有关[5]。在白榆[21]、蒙古扁桃[22]中发现低盐碱胁迫对种子萌发几乎没有抑制作用，可能是由于低浓度盐碱溶液促进了细胞膜的渗透调节，或是微量无机离子(Na+)对呼吸酶有刺激作用[21]，而高盐碱处理对种子萌发的抑制效果显著，推测可能是与盐碱离子的渗透效应和毒性效应有关，且盐碱胁迫程度越深，效应越显著[21]。Neamatollahi等[23]研究表明NaCl的浓度增加降低了茴香种子发芽率，与渗透压增加有关。杜鹃为酸性土指示植物，NaCl胁迫抑制了鹿角杜鹃[16]、马银花和映山红[19]的种子萌发，繁华杜鹃[17]种子萌发表现出“低促高抑”现象，说明杜鹃属植物在盐碱胁迫下的萌发也存在种间差异。

3.2 盐胁迫对杜鹃幼苗生长的影响

盐碱胁迫容易造成植物明显的发育迟缓，文献表明，植物在苗期和营养生长早期特别容易受盐碱度的影响[6,16]。在我们的研究中，盐碱胁迫降低了杜鹃属植物的出苗率、株高、根长、平均叶片数，幼苗在短期盐碱胁迫下的褐化率与盐碱胁迫呈正相关，在高浓度盐碱胁迫下，其幼苗无法存活，说明盐碱胁迫降低植物的生长速率，甚至造成胁迫死亡。盐度对植物生长有多种影响，土壤中盐的存在会导致根区水势降低，植物的吸水能力下降，这种生长反应与土壤溶液中所含盐分引起的渗透压作用[8]、Na+和Cl-、CO32+、HCO3-等离子的植物毒性、养分的不平衡抑制养分的吸收和运输[7]有关。大量研究表明，植物在盐碱胁迫下表现出根茎叶生长量的下降，高浓度胁迫甚至导致植株死亡[24-25]。也有研究表明，低浓度盐碱胁迫对幼苗生长具有促进作用[26-28]，较低浓度的盐碱胁迫会刺激同化物向根系分布[27]。

3.3 杜鹃属植物耐盐碱性的比较

目前对于杜鹃耐盐碱性多限于“喜酸不耐盐碱”的笼统描述，但对于具体的耐盐碱能力报道较少，鹿角杜鹃的种子在NaCl 胁迫下的耐盐适宜浓度、耐盐半致死浓度、耐盐极限浓度分别为25.62、55.60、95.57 mmol/L[16]，繁花杜鹃在低浓度(50 mmol/L)盐胁迫下种子萌发率提高，400 mmol/L盐处理种子几乎不发芽[17]。在本试验中，马银花、满山红、映山红、云锦杜鹃的盐适宜浓度分别为40.07、28.95、36.89、51.29 mmol/L，盐半致死浓度分别为61.84、47.35、67.16、100.24 mmol/L；碱适宜浓度分别为3.32、6.27、8.49、17.30 mmol/L，碱半致死浓度分别为8.21、12.81、15.84、29.23 mmol/L，杜鹃属植物的耐盐性存在种间差异。从适宜浓度、半致死浓度及杜鹃属植物幼苗生长来看，碱处理对杜鹃的胁迫程度高于盐胁迫。事实上，由Na2CO3、NaHCO3等碱性盐所造成的土壤碱化除了自由基、离子毒害，还存在高pH值危害，比由NaCl、Na2SO4等中性盐所造成的土壤盐化问题更加严重。宋庆云等[21]的研究也表明高碱(60 mmol/L)对白榆种子萌发的抑制效果要显著高于高盐的处理，在李志萍等[27]的研究中也有相似的结论。

植物对盐碱胁迫的敏感程度存在种间明显差异[7]，在本试验中，4种杜鹃属植物的耐盐碱能力不同，根据盐碱半致死剂量，4种杜鹃耐盐性从高到低排序为：云锦杜鹃>映山红>马银花>满山红，耐碱性从高到低依次为：云锦杜鹃>映山红>满山红>马银花，耐盐碱性排序略有差异，云锦杜鹃的耐盐碱性最好，其次是映山红，马银花和满山红的耐盐碱性最差。郁书君等[29]的研究表明，云锦杜鹃具有一定的耐碱性。抗性较强的云锦杜鹃在盐碱胁迫下萌发率、出苗率、褐化率的降幅相较于抗性弱的种要低。在Hasanuzzaman等[30]的研究中也发现，盐敏感的水稻品种在盐胁迫下萌发率更容易降低。盐碱胁迫抑制了杜鹃属植物种子萌发和幼苗生长。综合种子萌发和幼苗生长情况，云锦杜鹃是耐盐碱杜鹃培育的优良亲本。