丛枝菌根真菌对滇重楼根茎中碳氮代谢的影响

许凌峰，李卓蔚，周 浓，郭冬琴，赵晶晶

(重庆三峡学院 生物与食品工程学院，三峡库区道地药材绿色种植与深加工重庆市工程实验室，重庆 404120)

滇重楼作为中药材重楼的基原植物之一被《中国药典》收载，其根茎中主要含黄酮类、甾体皂苷、多糖类和氨基酸类活性成分。滇重楼多糖主要是由甘露糖、半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖和鼠李糖组成，具有显著的免疫增强功能和抗氧化作用[1]；中药材中的总氨基酸是药效的辅助成分或主要成分，具有调节内分泌和酶活性以及提高免疫力等药理活性[2]，多糖和总氨基酸作为中成药的主要成分极具研究开发价值。丛枝菌根真菌(AMF)作为土壤真菌和植物根系之间的共生联系，外源接种AMF在提高药用植物的移栽成活率[3]、增强药用植物抵抗病虫害的能力、增加药用植物根的营养吸收功能[4]、改善药用植物的产量和品质等[5-6]方面发挥着重要的作用。王骞等[2]通过测定不同产地的野生和移栽滇重楼发现，其在单糖组成方面无明显差异，故认为移栽滇重楼可代替野生滇重楼入药。杨芳等[4]采用日立L-8800氨基酸自动分析仪测定出滇重楼叶、茎、花和根茎中富含17种蛋白类氨基酸和1种特殊药效氨基酸—γ-氨基丁酸。虽然滇重楼根茎中的氨基酸含量较低，但十分易于被人体吸收，只要混配合理可对药效起到辅助作用。本课题组前期对28种不同AMF接种滇重楼进行了初步调查[7-8]，但接种AMF对滇重楼根茎内多糖和总氨基酸含量的影响鲜见报道。本研究以滇重楼为试验材料，通过外源接种不同的AMF进行处理，在果熟期和衰老期测定根茎内多糖、总氨基酸以及碳氮比，分析了AMF对滇重楼根茎品质的影响，以期为滇重楼高产优质栽培技术提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

DZF-型电热恒温真空干燥箱(上海博讯医疗生物仪器股份有限公司)；UV-2450型紫外可见分光光度计(日本岛津集团)；CP225D型分析天平(德国Sartorius公司)。D-无水葡萄糖对照品、薯蓣皂苷元对照品(批号：111590-200402、111591-200402，中国食品药品检定研究院，供含量测定用)；芦丁对照品(批号：100080-200707，中国食品药品检定研究院，供UV法含量测定)。试验所用的试剂均为分析纯。

1.2 试验设计

28种AMF购买自美国国际丛枝菌根真菌种质资源保藏中心(INVAM)，详情见表1，以不接种AMF为对照(CK)；滇重楼新鲜根茎取自大理州农科院的同一批样品，经重庆三峡学院周浓教授鉴定为百合科植物云南重楼(Parispolyphyllavar.yunnanensis)。栽培基质为菜园土与河沙按3: 1(V: V)混合，过2 mm筛，121℃高压灭菌锅内灭菌2 h。2013年2月24日采用室温盆栽方法，菌剂均匀层施于表土下滇重楼根部，接种剂量为每株1 mL，每盆播种5株幼苗，生长期间按常规管理，定期浇Hoagland营养液。分别于2013年8月(果熟期)和2013年11月(衰老期)收获滇重楼植株的根茎，45℃条件下烘干粉碎过筛(40目)，备用。

表1 接种丛植菌根真菌的不同处理组Table 1 Different treatment groups inoculated AMF

1.3 测定方法

1.3.1 滇重楼多糖提取和测定

采用蒽酮硫酸比色法[9]。称取1.0 g滇重楼根茎洗净后烘干粉碎，使用石油醚回流脱脂，滤渣按一定比例加入蒸馏水，采用超声辅助提取法进行提取，80%乙醇静置24 h后离心15 min，过滤、沉淀加蒸馏水定容至50 mL备用。精确量取2.0 mL供试溶液于10 mL具塞刻度试管中，快速加入6.0 mL蒽酮溶液(0.8 g蒽酮溶解于400 mL 80%浓硫酸中，现用现配)，摇匀，于沸水浴显色15 min，冷却后定容至10 mL，在625 nm波长下测定吸光度(A)，然后从标准曲线上查得供试溶液中多糖的浓度，按照公式计算出待测样品的多糖含量(mg·g-1)。

1.3.2 总氨基酸含量的测定

使用色谱分析法进行根茎内总氨基酸含量的测定[4]。准确称取 200 mg 的试样置于水解管中，加入10 mL 6.0 mol/L 盐酸溶液 ，抽真空后密封。将水解管置于恒温干燥箱(110 ± 2℃)中水解 22 h，冷却过滤备用。滤液使用6.0 mol/L NaOH 溶液调至中性，定容至 25 mL。吸取1.0 mL样品溶液与1.0 mL 0.02 mol/L HCl 溶液混合均匀后用水系滤膜过滤后进样，每次样品进样量控制在20 μL，反应器温度控制在 136.0℃，反应柱温度控制在57.0℃。

1.4 数据分析

采用Microsoft Excel 2013进行数据的录入、整理，用 SPSS 19.0做方差分析，用Origin 9.1软件绘图。

2 结果与分析

2.1 丛枝菌根对滇重楼总多糖含量的影响

由图1分析可知，与对照相比，接种不同的AMF对滇重楼根茎内多糖含量均有一定的影响，随着生育进程的推进，滇重楼根茎内的多糖含量逐渐升高，从整体趋势上看，AMF对果熟期内多糖含量的调控效果要好于衰老期。其中，接种Gg(巨大巨孢囊霉)、Gr(玫瑰红巨孢囊霉 )、Dh(异配盾孢囊霉)、Rfu(亮色盾巨孢囊霉)和Cc(近明球囊霉)均促进了根茎内的多糖含量，在果熟期时，其增长率依次为94.96%、135.63%、42.03%、35.37%和11.82%；在衰老期时，其增长率依次为16.41%、87.07%、42.16%、31.98%和42.21%， 方差分析可知，Gg、Gr、Dh、Rfu和Cc处理与CK间差异显著，这说明接种Gg、Gr、Dh、Rfu和Cc五种AMF有利于滇重楼根茎内多糖的积累。

2.2 丛枝菌根对滇重楼总氨基酸含量的影响

从图2中可以看出，与对照相比，接种不同的AMF对滇重楼根茎内总氨基酸含量均有一定的影响，随着生育进程的推进，滇重楼根茎内的总氨基酸含量逐渐降低。在果熟期和衰老期接种Sca(美丽盾巨孢囊霉)、Sdi(双紫盾巨孢囊霉)、Spe(透明盾巨孢囊霉)、Dh(异配盾孢囊霉)、Sde(沙荒球囊霉)、Rin(根内球囊霉)、Ako(何氏无梗囊霉)、Asp(刺无梗囊霉)、De(象牙白多孢囊霉)、Ds(沾屑多孢囊霉)、Po(隐类球囊霉)、Ale(薄壁两性囊霉)和Atr(崔氏原囊霉)均增加了滇重楼根茎内的总氨基酸含量，在果熟期，其增长了依次为14.61%、18.97%、24.47%、26.13%、51.12%、20.07%、90.58%、82.66%、37.00%、218.43%、65.65%、99.09%和109.28%； 在果熟期，其增长了依次为83.36%、78.90%、52.05%、99.03%、165.77%、48.35%、156.12%、47.56%、82.31%、166.22%、56.81%、26.55%和69.69%，方差分析可知，上述AMF处理与CK间差异达到了显著水平，植物体内的氨基酸主要来源于氮素的同化以及蛋白质等含氮化合物的降解，在植株器官形成初期其含量的增加有利于器官的形成，这说明接种上述AMF可以促进滇重楼根茎的形成，为其药用价值的改善奠定了基础。

图1 接种不同AMF对滇重楼总多糖含量的影响Fig.1 Effects of different AMF on polysaccharide content in P.polyphylla var.yunnanensis注：图中同一指标上不同小写字母表示不同处理之间差异显著(P<0.05)，下同。

图2 接种不同AMF对滇重楼总氨基酸含量的影响Fig.2 Effects of different AMF on total amino acids content in P.polyphylla var.yunnanensis

2.3 丛枝菌根对滇重楼碳氮比的影响

碳氮比可以体现植物的营养利用效率，是衡量植物体内碳和氮养分平衡状况的指标，也是植物生命过程的重要调节者和维持者，通常会趋向固定的比值，而环境条件的干扰会改变这一比值。由图3分析可知，随着生育进程的推进，滇重楼根茎内的碳氮比明显升高，在滇重楼根茎衰老期，根茎内的碳氮比值迅速升高，这说明经初级代谢提供给植物的有效成分所有增加，这有利于根茎的分化和形成。在果熟期和衰老期接种Gd(易误巨孢囊霉)、Gm(球状巨孢囊霉)、Gr(玫瑰红巨孢囊霉)、Cc(近明球囊霉)和Afo(孔窝无梗囊霉)均增加了滇重楼根茎内的碳氮比，方差分析可知，Gd、Gm、Gr、Cc和Afo处理与与CK间差异显著。

图3 接种不同AMF对滇重楼碳氮比的影响Fig.3 Effects of different AMF on C/N in P.polyphylla var.yunnanensis

3 讨论

多糖作为高等植物的光合产物以及碳水化合物代谢和暂时贮藏的形式，在植物体内碳代谢中占有重要的位置，铁皮石斛培苗组接种菌根真菌Mycenasp.移栽19个月后，其茎内的多糖积累和多糖化学性质形成的时间有所延长，随着生育进程的推进，菌根组的多糖含量始终低于对照组[10]；于5.0 mg·L-1硝酸镧水平下接种菌根真菌能促进铁皮石斛幼苗多糖的合成[11]，提高石斛根茎内的多糖含量[12]，Mycenasp.与金钗石斛无菌苗共生培养能够提高其多糖含量[13]；本研究发现，滇重楼接种AMF后，只有5个AMF(Gg、Gr、Dh、Rfu和Cc)可以显著提高滇重楼根茎内的多糖含量，从整体趋势上看，上述5个AMF对果熟期内多糖含量的调控效果要好于衰老期，这与前人的研究结果既有相同之处也有不同之处，这说明AMF对药用植物的调控效果主要受其自身的遗传特性和生育期的影响。

氨基酸作为蛋白质等含氮化合物分解与合成过程的中介物质，其含量变化可以反映植物体内的氮素代谢变化情况，因此可用氨基酸来反映植株体内氮代谢状况。Dixon等[14]认为接种菌根会导致植物根系对土壤中氨基酸吸收的减少，进而降低植物体内的氨基酸含量，但Azaizeh等[15]却认为接种菌根不会对根分泌物的质与量产生任何影响，外源接种AMF可以促进玉米根部所有氨基酸和总氨基酸含量的增加[16]。本研究发现，在果熟期和衰老期接种Sca、Sdi、Spe、Dh、Ale和At 等13种AMF均不同程度地增加了根茎内的总氨基酸含量，这说明接种上述AMF有利于滇重楼根茎内总氨基酸的积累。可见，并非所有的AMF都能促进药用植物体内多糖和总氨基酸的积累，而多糖和总氨基酸作为药用植物的主要活性成分，其含量的增加有利于改善药用价值[17]，故可以使用多糖和总氨基酸来作为筛选AMF的依据之一。碳氮代谢作为植物体内的两大主要代谢过程，其代谢强度以及二者的协调程度变化情况不仅会影响植物生长发育进程，而且还会影响植物产量的高低和品质的优劣。本研究结果表明，随着生育进程的推进，滇重楼根茎内的碳氮比明显升高，植物体内碳氮比的增加说明植物的初生和次生代谢产物的资源分配发生了改变，进而使植物叶片的营养物质及次生抗性物质含量等发生变化。在滇重楼根茎衰老期，根茎内的碳氮比值迅速升高，这说明经初级代谢提供给植物的有效成分所有增加有利于根茎的分化和形成，以及药用价值的改善。

4 结论

外源接种AMF可以不同程度地影响滇重楼根茎内的多糖和总氨基酸含量，随着生育进程的推进，滇重楼根茎内的多糖含量逐渐升高，而总氨基酸含量逐渐降低，其中，双紫盾巨孢囊霉(Sdi)和异配盾孢囊霉(Dh)均显著促进了滇重楼根茎内的多糖和总氨基酸含量，故建议滇重楼种子共生萌发时接种Sdi和Dh较为适宜。