饲料添加黄金虫虫粉对小鼠肠道炎症相关细胞因子表达的影响

金鑫鑫，巩宇红，袁渤雨，刘明明，吴文湘，陈 纯，苏铭信，王 玮,*

(1.吉林大学 动物医学学院，吉林 长春130062;2.仲恺农业工程学院 动物科学学院 健康养殖创新研究院，广东 广州 510225)

“黄金虫”蝇蛆是一种繁殖量很大的经济昆虫，是家蝇的幼虫，可以作为畜牧生产中的蛋白原料添加剂。蝇蛆中含有的抗菌肽属于阳离子碱性多肽，具有热稳定性和广谱抗菌性[1]。抗菌肽具有免疫调节作用，能促进免疫细胞增殖、激活特异性免疫应答反应、消除炎症、增强宿主抵抗力和调节免疫因子活性等[2]。抗菌肽还能有效抵抗外来病原微生物的侵害[3]。

黄金虫干虫蛋白质含量50%以上，此外，还含有磷、钾、铁、钠、铝等常量元素和多种微量元素，以及动物生长所必需的18种氨基酸[4]。甲壳素是黄金虫体内宝贵的天然生物资源,主要分布于外表皮,黄金虫中的甲壳素含量高于虾蟹壳，具有提高免疫力、抗菌抗感染、抗病毒的作用[5]。黄金虫干粉中含有脂溶性和水溶性维生素，水溶性微生素中B族的含量非常丰富，尤其是维生素B2和维生素B12[6]。黄金虫体内含壳聚糖，可增强小鼠的细胞免疫、体液免疫、单核巨噬细胞功能和NK细胞活性，对动物机体具有多种免疫调节作用[7]。

小鼠肠道防御素包括Cryptdin-1、Cryptdin-5等，它能杀死入侵机体的病原体，也能调节机体的免疫功能[8]。当小鼠肠道受到病原菌侵害时，炎性细胞因子的表达量会明显变化[9]。本试验以小鼠为模式动物，通过日粮添加不同比例的黄金虫虫粉，观察不同添加比例的黄金虫虫粉对小鼠肠道不同部位炎症相关细胞因子及鼠源抗菌肽表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料黄金虫干粉由广东金农良品有限公司提供，用粉碎机粉碎后，以5%，10%，20%的比例添加到鼠粮干粉中，混匀后制作成鼠粮。

1.2 实验小鼠及分组选用体质量为(43±2) g的6～8周健康雄性昆明种小鼠28只，随机分为4组：对照组、5%黄金虫添加组、10%黄金虫添加组和20%黄金虫添加组。对照组小鼠添加正常鼠粮，试验组分别添加含5%，10%，20%黄金虫虫粉的鼠粮，正常饮水，饲喂2周。

1.3 小鼠腹泻模型诱导从-80℃冰箱取出鼠伤寒沙门菌(菌株编号：SL1344)菌株融化复苏后，接种到BHI液体培养基，37℃恒温摇床上过夜培养，收集细菌，调节浓度到 1×108CFU/mL。给小鼠灌胃0.05 mL/g的沙门菌菌液建立腹泻模型，连续3 d，诱导产生腹泻模型，记录腹泻及死亡情况。

1.4 组织RNA的提取从-80℃冰箱中取出50 mg 样品，放入液氮中，然后再在5 mL离心管中加入适量的液氮，多次用玻璃棒研磨至粉末状。加入1 mL TRIzol，于室温放置10 min，使其充分裂解，并将液体转移至1.5 mL离心管中。按照200 μL 氯仿/mL TRIzol，加入200 μL氯仿，剧烈振荡15 s，室温放置10 min，于4℃ 12 000 r/min离心10 min。取出，室温放置约2 min，等出现白色沉淀后，吸取上清水相，移入另一个离心管中，注意不能吸入脂肪层，按500 μL异丙醇/mL TRIzol，加入500 μL异丙醇，盖盖，上下颠倒10次，-20℃过夜。第2天取出融化后4℃ 12 000 r/min离心10 min,弃去上清液，此时管底的沉淀即为RNA。加入75%乙醇1 mL，然后平拿离心管，慢慢转几圈，将乙醇吸出。再加入75%乙醇 1 mL，转几圈后再将乙醇移除。RNA先是白色，然后慢慢变成透明状态。等沉淀几乎透明后，加入20 μL的DEPC水，振荡至沉淀溶解后测定RNA浓度。

1.5 荧光定量PCR检测炎性因子取小鼠空肠、回肠和结肠，提取RNA，并反转录为cDNA，然后做相对荧光定量PCR，检测小鼠体内空肠、回肠和结肠中的抗炎因子、促炎因子和抗菌肽的相对表达量。

促炎因子：TNF-α、IL-1β、IL-6；抗炎因子：IL-4、IL-10、IL-13；抗菌肽：Ang-4、Cryptdin-1、Cryptdin-5、Lyz2、Crs1c、Reg3r。

采用实时荧光定量PCR法检测小鼠灌菌前后肠道炎性因子的表达水平变化。将得到的RNA 反转录成cDNA后，按荧光染料10 μL，上下游引物各1 μL，cDNA 8 μL，总体系20 μL加样，每组3个重复，混匀后离心，进行荧光定量检测。引物序列如表1。

2 结果

2.1 腹泻模型的建立结果显示，对照组7只小鼠，6只出现腹泻现象，死亡1只；5%黄金虫添加组7只小鼠，2只出现腹泻，未死亡；10%黄金虫添加组7只小鼠、20%黄金虫添加组7只小鼠，均未出现腹泻或死亡现象。

2.2 黄金虫饲喂对小鼠空肠炎性因子相对表达量的影响结果表明，日粮中添加黄金虫虫粉，小鼠灌胃沙门菌后，空肠中促炎细胞因子表达量降低，抗炎细胞因子表达量升高，抗菌肽表达量也升高，这有利于小鼠的生长发育，提高小鼠抵御炎症反应的能力。空肠为小肠，主要起消化吸收作用，促炎因子、抗炎因子和鼠源抗菌肽的表达量会影响小鼠的生长发育及抗病能力。

表1 引物序列及扩增产物长度

2.2.1肿瘤坏死因子(TNF-α) 见图1。结果显示，黄金虫虫粉添加组TNF-α表达量均降低，其中20%组最为显著。

2.2.2抗炎因子 见图2。结果显示，与对照组相比，黄金虫虫粉添加组空肠中抗炎因子IL-4、IL-10和IL-13的表达量均升高，其中20%添加组差异显著或极显著。

注：*.P<0.05;**.P<0.01;***.P<0.001。下同

2.2.3鼠源抗菌肽 见图3。结果显示，空肠中抗菌肽Ang4、Cryptdin-1、Cryptdin-5、Lyz2、Reg3r和Crs1c的表达量较对照组都有明显上升。Ang4、 Cryptdin-1、Cryptdin-5和Crs1c的表达量随着黄金虫添加比例的增加而上升，20%添加组最为显著。Lyz2、Reg3c的表达量5%添加组最高，与对照组有显著性差异，10%添加组和20%添加组比5%添加组低，但均高于对照组。

2.3 回肠炎性因子相对表达量

2.3.1促炎因子 见图4。结果显示，黄金虫虫粉添加组回肠中的促炎因子IL-6表达量较对照组明显降低。

图2 空肠抗炎因子IL-4、IL-10和IL-13的表达量

2.3.2抗炎因子 见图5。结果显示，黄金虫虫粉添加组回肠中的抗炎因子IL-4、IL-10和IL-13的表达量较对对照组均有所上升。

2.3.3鼠源抗菌肽 见图6。结果显示，试验组回肠中抗菌肽Ang4和Crs1c的表达量较对照组明显上升，其中Cryptdin-1、Cryptdin-5和Reg3r的表达量10%添加组最高，其他组表达量均低于对照组。

2.4 结肠炎性因子相对表达量见表7～9。结果

图3 空肠抗菌肽Ang4、Crs1c、Cryptdin-1、ryptdin-5、Reg3r和Lyz2的表达量

图4 回肠促炎因子IL-6的表达量

显示，黄金虫虫粉添加组中结肠的促炎因子TNF-α和IL-6的表达量较对照组均降低，而抗炎因子IL-13表达量试验组较对照组增高,IL-4的表达量略微降低，IL-10变化不明显。试验组结肠的抗菌肽Ang4、Cryptdin-1、Reg3r和Crs1c的表达量较对照组都有明显上升。其中，Ang4的表达量随着黄金虫添加比例的增加而上升，且20%添加组中最为显著，而Cryptdin-1的表达量在5%添加组中最高、Reg3r的表达量在10%添加组中最高。

2.4.1促炎因子 见图7。结果显示，黄金虫虫粉添加组中促炎因子TNF-α和IL-6的表达量与对照组相比，均呈降低趋势。

2.4.2抗炎因子 见图8。结果显示，黄金虫虫粉添加组中抗炎因子与对照组相比，IL-4表达量下降，IL-10变化不明显，IL-13升高。

2.4.3鼠源抗菌肽 见图9。结果显示，与对照组相比，黄金虫虫粉添加组抗菌肽表达量均增加。

图5 回肠抗炎因子IL-4、IL-10和IL-13的表达量

图6 回肠抗菌肽Cryptdin-1、Cryptdin-5、Reg3r、Ang4和Crs1c的表达量

图7 结肠促炎因子TNF-α和IL-6的表达量

图8 结肠抗炎因子IL-4、IL-10和IL-13的表达量

3 讨论

黄金虫粉末中富含甲壳素和壳聚糖，对动物生长发育有促进作用。杨冬之等[10]研究证明壳聚糖分子吸附到细菌细胞壁上，使细胞壁和细胞膜上负电荷分布不均，干扰细胞壁合成，导致细菌裂解而死亡。

当沙门菌感染小鼠时，动物肠道菌群失调，肠道免疫屏障被破坏，会导致肠道炎症的发生，出现腹泻症状或死亡[11-12]。日粮中添加适当比例黄金虫虫粉，能提高小鼠的机体免疫力，在沙门菌侵害肠道时，能增加肠道对病原菌的抵抗力以及提高机体抵御炎症反应的能力，维持肠道菌群的平衡，对沙门菌破坏肠道有一定抵抗作用[13]。本试验结果显示，对照组6只小鼠出现腹泻症状，1只死亡；试验组5%黄金虫添加组中2只小鼠出现腹泻症状，而10%黄金虫添加组、20%黄金虫添加组小鼠没有出现腹泻及死亡的情况，这验证了黄金虫虫粉的添加能保护小鼠肠道对抗沙门菌的侵害。

图9 结肠抗菌肽Ang4、Crs1c、Cryptdin-1和Reg3r的表达量

虽然各组在不同肠道中每种因子的表达量不同，总体上看，按20%黄金虫比例添加的试验组，各种因子趋势最明显，但有个别抗菌肽因子如Cryptdin-1、Cryptdin-5和Reg3r虽有降低，但均高于对照组。而添加10%比例黄金虫的试验组，虽个别细胞因子涨幅没有20%组明显，但对于细胞因子和鼠源抗菌肽的产生都具有积极的调控作用；因此，10%添加量对动物的生长及免疫力具有较好的促进作用。

有研究证明，蝇蛆粉可以提高水产动物的抗病能力、成活率和增重率。黄国庆等[14]研究证明蝇蛆代替人工饲料喂养罗非鱼能增强鱼体的免疫力，提高成活率，试验组的日平均增重率显著高于对照组。李广宏等[15]研究表明，蝇蛆蛋白饲喂的麻鸡其蛋白质含量明显高于普通日粮对照组。王颖娟等[16]观察日粮中添加不同比例鲜蝇蛆对兴义矮脚鸡生长速度、产肉性能及肉品质的影响，发现鲜蝇蛆饲喂兴义矮脚鸡可以加快生长速度，降低鸡肉中的水分含量，提高肌肉的营养价值。LI等[17]研究猪饲料中添加8%蝇蛆粉对宁乡猪生长性能和肠道微生物平衡的影响，结果发现饲料中添加8%蝇蛆粉可以显著增加育肥猪的平均日增重，抑制肠道有害菌的生长，促进益生菌的增殖，并且有效提高对营养物质的消化吸收能力。

总之，黄金虫作为饲料添加剂应用于畜禽养殖，是无抗养殖的一种新的尝试，可以作为蛋白质饲料的有益补充，同时可以提高机体的免疫机能对抗肠道局部炎症，还能避免细菌耐药性的出现。黄金虫虫粉能作为营养物质，调节肠道炎性因子的表达，有望作为蛋白替代物应用到饲料添加剂中。因此，本研究为开发新型饲料或饲料添加剂提供一定的试验依据。