花粉源面积对水稻花粉扩散的影响

王转娥，吴永涛

（1.海南大学 热带作物学院，海南 海口 570228；2.甘肃省张掖市气象局，甘肃 张掖 734000）

水稻是中国重要的粮食作物，种植面积常年在3000万hm2左右，水稻生产肩负着保卫中国粮食安全的重要责任[1]。近几年来，水稻转基因技术发展快速，水稻基因飘流研究的热度越来越高。我们获取水稻基因飘流规律的主要方法之一是田间试验。Song等[2-3]通过设计长方形试验，研究得出明恢63向普通稻的最大基因飘流距离为43.2m，明恢63向红稻和普通野生稻的最大基因飘流率分别为0.011%～0.046%和1.21%～2.94%；Messeguer等[4]采用了同心圆的设计，研究了转基因水稻在不同方向的基因飘流率，研究表明转基因水稻在不同方向上向非转基因水稻品种Senia和红稻的最高基因飘流率为0.53%；戎俊等[5]得出常规稻品种Huangkenuo和Shangyou-63之间的基因飘流率为0.04%～0.18%；程林等[6]得出转基因水稻向不同受体的基因飘流率有显著差异，基因飘流率不但与受体的异交特性紧密相关，还与试验地的风向、风速等气象因素有关。

水稻转基因逃离的重要路径之一是花粉介导的基因飘流[7]。在这个过程中，基因飘流率是花粉扩散过程和受精结实过程的综合结果。花粉作为遗传物质的承载体，花粉浓度决定了基因飘流率的分布[8]，表现在基因飘流率和花粉浓度均随着距离的增加而呈现负指数衰减[9]。但是在以往的研究中，很少有直接观测水稻花粉扩散的。其中，Song等[2]设计了6个不同面积的花粉源，处理了1-5个面积分别是半径为0.3m、0.6m、1.2m、2.4m和4.8m的圆形花粉源，第6个处理为103.6m的矩形花粉源，结果发现水稻花粉的扩散随着与花粉源之间距离的增加而减少，在给定的范围内，花粉浓度与花粉源大小呈正相关关系。但是，上述田间试验存在的最大缺陷就是花粉源面积。Song等、Scheffler和Timmons通过对比不同面积的花粉源发现，花粉源大小也是影响花粉传播距离的一个重要因素，花粉浓度会随着花粉源面积的增大而增加。未来转基因水稻商业化种植后，转基因水稻的面积将远远超过目前水稻试验中的花粉源面积，目前试验中只有半径为0.3m、0.6m、1.2m、2.4m和4.8m的圆形，边长为5m、10m和15m的正方形以及面积为6310m2的矩形花粉源。由此可以推断，当前对于转基因水稻的基因飘流风险存在明显的低估。

在上述研究背景下，本研究共设计了5m×5m（T1）、10m×10m（T2）、15m×15m（T3）和 340m×130m（T4）4 种花粉源面积，由有效穗数、每穗的开花颖花数和单个颖花的花粉量的实测值计算出各个处理的花粉释放量；根据主风向上不同距离的花粉沉降量和对应的气象数据，运用Excel进行数据处理和绘图，描述不同处理的花粉沉降量在时空分布上的特征，以期为合理规划转基因水稻的隔离距离提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验设计

在2017年4-11月份的江苏省镇江市京口区新民洲共青团农场进行了该试验。试验中所选用的两个花粉源品种分别为“特籼占25”和“陵两优”。其中，“陵两优”于2017年4月20日播种，“特籼占25”于2017年5月8日播种。所有材料均于6月4日移栽，移栽密度为17cm×30cm。“陵两优”的开花期为7月4-14日，平均株高为0.8m。“特籼占25”的开花期为8月21-28日，平均株高为1.2m。以上试验的花粉源采用正方形和矩形两种设计方式，设置4个处理。其中，“陵两优”试验有3个处理，花粉源面积分别是 5m×5m（T1）、10m×10m（T2）、15m×15m（T3）；“特籼占 25”试验只有 1 个处理，花粉源面积为340m×130m（T4）。为了减少处理之间的相互干扰，“陵两优”试验采用距离隔离，T1、T2、T3垂直于盛行风向依次排列，间隔距离超过40m。“特籼占25”试验采用花期隔离，通过调整花粉源的播种期，使之比其他水稻提前1-2个月开花。

1.2 试验观测

1.2.1 气象因子

为了得到实时的气象资料，在两个品种开花期间，试验田内的空气温度和相对湿度由芬兰产的HMP155A型温湿度传感器测得；风速和风向由美国产的010C和020C型风速/风向传感器测得；太阳总辐射由美国产的LI200X型短波辐射传感器测得。所有传感器均安装在试验田中央，其高度距离地面2.0m（距离冠层顶1.0m），实测所得的气象数据由美国产的CR3000型数据采集器采集和存储，采集器的采样频率为1Hz，每半小时存储一次各气象因子平均值。天气情况由人工观测记录。

由以上方法得到的气象数据可知，“陵两优”品种开花期间平均风速为2.3m/s；主风向为南风，空气相对湿度为68.3%～84.1%；日平均气温为27.0℃～32.2℃。7月6日和7月8-10日有持续性降雨,这个时间段未进行花粉扩散的观测，因为在降雨天气条件下即便有开放的颖花，花粉也会因过量吸水而膨胀破裂。“特籼占25”品种开花期间平均风速1.32m/s；日平均气温为24.7℃～30.5℃；空气相对湿度为-2.6%～10.6%。该时期没有降水，风速比较小且相对湿度很低，天气干燥。

1.2.2 花粉释放量

这里的花粉释放量指的是从水稻花药中能够释放到大气中的最大花粉量。它包括花粉源面积和单位面积的花粉源强两个量。单位面积的花粉源强（粒/m2）的算法是单位面积的有效穗数、每穗的开花颖花数和单个颖花的花粉量三者的乘积。水稻抽穗后，在每个处理中任意选取30穴，统计出每穴的有效分蘖数，然后乘以移栽密度，即可得到单位面积的有效穗数（穗/m2）。在开花期来临前，每个处理采用随机方式预先选取18个有效分蘖，自标记的分蘖开始开花起直到开花结束（7月4-14日和8月21-28日），于7：00-16：00的每个整点剪去并记录已开放的颖花，这就是每穗开花颖花数的日变化，将之累计求和，求得每个分蘖的开花颖花数。在开花盛期，采集尚未开放的颖花将其剥除颖壳后把花药放入65℃的烘箱中干燥，待花药完全裂开后，在离心管中加入20%的偏磷酸钠（NaPO3）6溶液，振荡摇匀成后制成6ml的花粉悬浮液。然后，利用血球计数板统计单位体积溶液中的花粉量，计算得到单个颖花的花粉量（粒·颖花-1）。为了减少试验误差，以上试验需重复3次。

1.2.3 花粉沉降量

本试验采用Durham法获取花粉浓度，利用涂有凡士林的载玻片捕捉大气中的花粉颗粒。因此，这里用花粉沉降量表示花粉浓度，即沉降到载玻片上的花粉密度（粒/cm2）。在开花期间，每日的7：00将涂有凡士林的载玻片水平放置在观测支架上，观测支架在田间的水稻冠层高度。每日的16：00收回全部的载玻片，其中7月4-5日和7月7日因为下午有降水，提前收回了载玻片。收回的载玻片用显微镜观察花粉数量。为了减少花粉沉降量的观测误差，本研究在每个载玻片上按顺序选取了50个视野，读取了每个视野的花粉数量后，再除以视野面积，得到每日的花粉沉降量（粒/cm2·d-1），整个开花期的花粉沉降量之和为总的花粉沉降量（粒/cm2）。T1、T2、T3处理各有11个花粉沉降量的观测点，相邻观测点之间的距离分别为 1m（T1）、2m（T2）和 3m（T3），T4 处理共有34个花粉沉降量的观测点，相邻观测点之间的距离为10m，它们都位于花粉源的中轴线上，沿着风向方向由南向北依次分布。其中T1、T2花粉源区内有6个观测点，下风区也有6个观测点，观测点“O”位于花粉源区和下风区边界线上，是两个区域共有的观测点，T4在花粉源区内有31个观测点，下风区有4个观测点，由于面积比较大，所以大部分的观测点都在花粉源区内部。所有观测点的高度均为穗顶高度。

1.3 计算比例

从花药中释放出来的所有花粉可分成两部分：一部分是落在花粉源区内，这些花粉不会发生基因飘流，对其他风媒物种无风险。另一部分花粉会扩散至花粉源区以外，当这些花粉落在其他稻种的柱头上就会发生基因飘流。为了量化这种基因漂流风险性，用有效源强比来反映这种风险，即源区外的花粉沉降量占总花粉沉降量的比例。

2 结果与分析

2.1 花粉沉降总量的空间分布

经T1、T2、T3、T4处理的花粉沉降总量均为先上升达到最大值然后再下降的试验结果，特别是由于T4处理的面积大，花粉沉降总量达到最大值后就不再增加，但是因为水肥不均的因素就会出现振荡情况。可见，4种处理空间变化趋势大致相同，且最大值都出现在花粉源区内部。产生上述相同现象的原因包括两个方面，首先，由于花粉的不断释放，大部分会沉降在花粉源内，使得花粉沉降总量在距离增加时不断增大。其次，由于风速的影响，花粉从花药中释放出来后就会随着风向向下游扩散稀释，使得上风向的一部分花粉被吹到下风向，从而在花粉源区的下风方向达到一个花粉沉降总量的最大值。当接近花粉源区边缘处时，花粉来源不断减少，花粉源区外的花粉只能被风带动扩散出去。所以在往花粉源外部扩散时，花粉沉降总量会随着与源区之间距离的增加而不断下降，就使得空间分布特征大致呈先上升后下降的趋势。但是，不同处理之间也是存在明显差异的。首先，相同距离上的花粉沉降总量大小为T4＞T3＞T2＞T1，其最大值也在不断增大。其中，T1为309.5粒/cm2、T2 为 390.9 粒/cm2、T3 为 450.9 粒/cm2、T4 为1242.45粒/cm2。其次，当其面积越大时，花粉沉降总量的最大值距离原点越远，即越靠近花粉源内部。T1、T2、T3、T4的最大值距原点的距离分别为2m、4m、6m、190m。最后，花粉源面积越大时，花粉向花粉源区外扩散的距离越大，随着T1、T2、T3、T4面积增大，其扩散到源区外的距离分别为5m、10m、15m和30m。

造成处理间差异的原因是：随着花粉源面积的不断增大，4种处理的释放量也几乎成倍增加，这使得相同距离上的花粉沉降总量也在不断增长。此外，风速、温度、湿度等气象条件在空间上的分布也会对花粉的扩散产生一定影响：风速越大，扩散距离越大；在其他条件相同时，湿度越大，花粉含水量越大，花粉扩散距离越小。由于花粉里面含有遗传物质，对于转基因水稻而言，这些遗传物质中包括外源基因，如果扩散超出花粉源区的范围，就有可能落在其他非转基因品种的柱头上受精结实，从而带来基因污染和其他生态问题。因此，这里计算了花粉源外部的花粉沉降总量占花粉释放总量的比例。如表1所示，随着面积的增大，扩散出去的花粉也越来越多，但是增加幅度和占比却越来越小。我们可以推测随着花粉源面积继续增大，花粉源外部的花粉沉降总量会趋向于一个定值。当研究面积小于这个花粉沉降总量临界值的面积时，由此所得到的基因飘流率就会被低估。

表1 不同处理花粉源外部花粉沉降总量占内部沉降总量的比例

2.2 花粉沉降量的时间变化

花粉沉降量的时间变化具有相同点，3种处理方式的花粉沉降量均从起始值先上升到峰值后再下降。其中，7月4日至7月7日，3种处理的花粉沉降量都比较低，平均值为 T1：23.57 粒/cm2、T2：25.67 粒/cm2、T3：31.96粒/cm2。7月7日至11日，由于降雨，未对花粉沉降量进行观测。7月12日天气转晴后，花粉沉降量增加迅速达到峰值，然后又下降。T4在8月21日至24日先是上升到23日的峰值148.51粒/cm2，然后下降到47.72粒/cm2。其次，7月4和14日、7月5和7日以及7月12和13日这三个时间段的花粉释放量大致相同，而此时T1、T2、T3的花粉沉降量最大值都有相同的差异性，花粉沉降量7月14日＞7月4日、7月7日＞7月5日、7月12日＞7月13日，而且面积越大其差值越大。可见，T1、T2、T3花粉沉降量时间变化趋势大致相同，最大值都出现在同一天。

但是，不同处理之间也有明显的差异。第一，T1、T2、T3 这 3 种处理每日的花粉沉降量 T3＞T2＞T1，且 T1、T2、T3的花粉沉降量的峰值分别为92.52粒/cm2、126.42粒/cm2、152.09粒/cm2。第二，其花粉沉降量的增加并不随面积成倍增加。T2、T3的峰值分别为T1的1.36倍和1.64倍，并且增加幅度在逐步减小。第三，T1、T2、T3共用9天时间才达到花粉沉降量的峰值，而T4用了3天时间就达到了第一个峰值，在花粉沉降速度上T4明显大于T1、T2和T3。第四，T4在8月21日至8月28日的时间段内，它的时间变化曲线出现了两个峰值，而T1、T2和T3只有一个峰值。由此可见，T1、T2、T3虽然随时间的变化趋势大致相同，但是其日花粉沉降量却有差异，且花粉沉降速度都不相同。

形成上述现象的内因是花粉释放量的变化以及花粉源面积的不同。如图1所示，花粉释放量的变化是从5.70×105粒/穴开始先略微降低然后一直增大到最大值9.41×105粒/穴之后再下降。由于7月4日至7月7日是阴雨天气，所以花粉释放量都很少且释放量大致相同，进而影响了花粉沉降，因此，T1、T2、T3的值都比较低且大致相等，它们的时间变化特征也大致相同。7月11日后由于天气转晴，花粉释放量和沉降量均迅速增加，7月12日花粉释放量达到最大值，此时T1、T2、T3的花粉沉降量也达到了峰值，分别是T1为92.52粒/cm2、T2 为 126.43 粒/cm2、T3 为 152.09 粒/cm2，然后花粉释放量减少，所以花粉释放量的变化趋势直接导致了T1、T2、T3具有相同的变化趋势。其次，面积的不同造成了每日沉降量 T4＞T3＞T2＞T1 的结果，T2、T3、T4面积分别为T1面积的4倍、9倍和1768倍，而且由于T4的面积大得多，所以其相同时间内的花粉释放量远远高于其他三种处理，且花粉沉降量达到峰值的时间也更短。

图1 花粉释放量变化特征

形成上述现象的外在原因是气象条件，直接原因是风速、温度等的直接作用。温度上升时，会促进花粉的释放和花粉的扩散；风速增大时，会将花粉从花药中吹出来；湿度对花粉的释放也有一定的影响，湿度比较大时，花药含水量增加不利于花粉从花药中释放出来。

间接原因是水稻品种和生育期特性对气象条件的选择。水稻花粉源强一方面是由开花习性决定的，开花量随时间的变化为正态分布或泊松分布[10]，主要由品种特性决定；但气象条件也会影响水稻开花，最适温度为28℃-32℃，最适相对湿度为80%-90%，当气温低于20℃、相对湿度低于60%或者有露水时，不利于颖花开放，散粉期将延长[11]。气象因子对不同品种的影响程度不同，影响籼稻开花的主要气象因子是温度，次要是风和日照；对于粳稻而言，温度、湿度是影响其开花的主要因素，其次是日照[12]。另一方面，气象条件也影响着花粉从花药中脱落。有学者的研究表明，有风时，植株晃动可以加速花粉的脱落。

3 结论

水稻花粉是遗传物质的承载体，会在风的作用或者其他动物的传播下扩散到其他地方。当它们落在花粉源区外的其他品种上受精结实时就会发生基因飘流。因此当评估转基因水稻的基因飘流遇到风险时，水稻花粉扩散规律对其有着重要的现实意义。

首先，花粉来源直接决定花粉量的多少，所以决定花粉扩散的内在因素是花粉源强。因为作物品种不同，其开花特性也存在差异，这种特性的差异造成作物花粉源强有着显著的日变化。大多作物的散粉都是从日出后开始，在日出后4h左右达到顶峰[11]。但是由于每个试验都有不同的试验条件或存在试验误差，且因为作物品种、生育性状的不同，以及其种类的差异，所以得到的花粉源强大小会有明显的区别[12-14]。另外，由于不同的研究人员选择的花粉源大小也有差别，所以这些人为原因同样是造成花粉浓度存在明显差异的重要因素[15-20]。

在转基因飘流中我们密切关注的指标之一是花粉扩散距离。花粉扩散距离决定着基因飘流的范围，研究花粉扩散距离对防范这种基因飘流风险有着重要的意义。不同的研究中得出的花粉扩散距离不同，花粉源大小对花粉扩散的影响并没有明确的结论。本研究设置了5m×5m、10m×10m、15m×15m 和 340m×130m 4种不同的花粉源大小，通过对比分析，对花粉源大小和花粉扩散之间的联系进行了讨论。结果发现随着花粉源面积的成倍增加，花粉沉降量并没有成倍增加，且其扩散到花粉源区外的花粉沉降量占源区花粉沉降总量的比例越来越小，分别为 T1：23%、T2：20%、T3：19%、T4：7%。虽然随着面积的增大，扩散到源区外的花粉量越来越多，但其增加趋势在逐渐减缓，由此我们可以推测当花粉源大小增加到一定的程度后，花粉沉降量将会趋向一个定值，花粉源面积再增大时花粉沉降量将不再增加，Rong[21]等人的试验因为花粉源面积较小，所以无法发现这个饱和现象。