广东省慢性化脓性中耳炎患者耳分泌物的病原体分布及药物敏感性分析

伍众文,陈玉婵,黄建宇,廖 康,郭鹏豪△

1.中山大学附属第一医院检验科，广东广州 510080；2.广州中医药大学顺德医院附属勒流医院检验科，广东佛山 528322

慢性化脓性中耳炎(CSOM)是中耳和乳突腔的慢性炎症，其特征为脓液从中耳通过穿孔的鼓膜排出，是耳鼻喉科最为常见的疾病之一[1]。该病在发展中国家较为常见，易反复发作，病程较长且不易根治，因长期反复化脓破坏中耳传音结构，导致听力受损[2]。由于广谱抗菌药物的大量及不合理使用，导致病原体种类及耐药性都出现了一些变化，因此对于CSOM患者耳分泌物进行病原学监测及药物敏感性分析对于临床选用抗菌药物具有重要的指导意义。本研究通过对广东省1 892例CSOM患者耳分泌物微生物培养的结果进行分析，以期为临床的诊断和治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2015年1月至2019年12月在中山大学附属第一医院耳鼻喉科住院治疗的广东省内的CSOM患者1 892例，其中男878例，女1 014例；年龄1～84岁，中位年龄41岁；非胆脂瘤型1 438例，胆脂瘤型454例；745例患者累及左耳，599例累及双耳，548例累及右耳。

1.2方法

1.2.1耳分泌物的采集 用75%乙醇清洁耳廓及外耳道皮肤，用无菌生理盐水浸润的耳棉拭子在患者外耳道深部鼓膜表面或鼓室内蘸取分泌物，标本采集后尽快送到实验室检测。

1.2.2标本培养及微生物鉴定 标本同时接种血平板、巧克力平板和沙氏平板。血平板、巧克力平板置于37 ℃、5%CO2孵箱进行孵育；沙氏平板置于28 ℃孵育。菌种通过法国生物梅里埃公司Vitek MS基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF MS)微生物分析系统进行鉴定。对于无法鉴定的微生物通过分子生物学测序的方法进行菌种鉴定。细菌的分子生物鉴定采用通用引物1492r/F27；真菌采用通用引物ITS1/ITS4[3]。

1.2.3微生物的药物敏感性检测 细菌的药物敏感性通过Vitek 2全自动微生物鉴定及药物敏感系统(法国生物梅里埃公司)进行检测；念珠菌、隐球菌通过ATB Fung3真菌药物敏感性检测试剂盒(法国生物梅里埃公司)检测，包括：5-氟胞嘧啶、两性霉素B、氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑5种抗真菌药物；丝状真菌药物敏感性检测根据美国临床和实验室标准协会(CLSI)M38-A文件的要求[4]，通过微量肉汤稀释法检测两性霉素B和伏立康唑的药物敏感性。细菌、酵母菌及丝状真菌的判断折点分别依据CLSI M100-S29、CLSI M27-S4[5]、CLSI M51-S1[6]进行判断。对于无判断折点的药物仅统计抑制50%、90%受试菌所需最小抑菌浓度(MIC50、MIC90)和最小抑菌浓度(MIC)范围。

1.3统计学处理 采用EXCEL软件对于病原体的检出率进行统计分析。通过Whonet5.6软件对病原体的药物敏感性结果进行分析。计数资料以频数、率表示，组间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1CSOM患者耳分泌物中病原体检出情况 1 892例患者中1 000例(52.9%)患者的耳分泌物标本无任何微生物生长或者仅有少量的皮肤定植菌生长，387例(20.5%)单纯细菌生长，343例(18.1%)单纯真菌生长，162例(8.6%)细菌混合真菌生长。共检出1 054株微生物，其中细菌549株，真菌505株；细菌检出率前3位的菌种分别是金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、铜绿假单胞菌；真菌检出率前3位的菌种分别是近平滑念珠菌、聚多曲霉、黄曲霉。见表1。

表1 CSOM患者耳分泌物中检出的病原体构成比

2.2不同类型CSOM耳分泌物中病原体的分布情况 胆脂瘤型和非胆脂瘤型患者曲霉菌、铜绿假单胞菌、肠杆菌科细菌的检出率比较，差异有统计学意义(P<0.05)，曲霉菌在非胆脂瘤型患者中检出率较高，铜绿假单胞菌、肠杆菌科细菌在胆脂瘤型患者中检出率较高。见表2。

表2 胆脂瘤型与非胆脂瘤型患者病原体的种类及分布[n(%)]

续表2 胆脂瘤型与非胆脂瘤型患者病原体的种类及分布[n(%)]

2.3病原体的药物敏感性分析

2.2.1革兰阳性球菌的药物敏感性分析 革兰阳性球菌中最常见的分离菌是金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌，2种细菌除对青霉素G、红霉素的敏感率较低外，对其他抗菌药物都具有较高的敏感率；耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的检出率为20.5%，耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌(MRScon)的检出率为40.0%；2种细菌对各种抗菌药物的敏感率比较，仅有苯唑西林与青霉素G对2种细菌的敏感率差异有统计学意义(P<0.001)。见表3。

表3 金黄色葡萄球菌及凝固酶阴性葡萄球菌对常用抗菌药物的敏感率(%)

2.2.2革兰阴性杆菌的药物敏感性分析 在分离的革兰阴性杆菌中以铜绿假单胞菌为主，其次是肠杆菌科细菌中的奇异变形杆菌。铜绿假单胞菌对于常用抗假单胞菌药物的敏感率均高于85.0%；奇异变形杆菌对第三、四代头孢、喹诺酮类及碳青霉烯类药物的敏感率均高于85.0%。2种菌对氨曲南的敏感率比较，差异有统计学意义(P=0.001)。见表4。

表4 铜绿假单胞菌及奇异变形杆菌对于常用抗菌药物的敏感率(%)

2.2.3常见念珠菌的药物敏感性分析 检出率前3位的念珠菌分别是近平滑念珠菌、西弗念珠菌和白色念珠菌。近平滑念珠菌对于氟康唑、伏立康唑的敏感率分别为96.9%、100.0%；白色念珠菌对于氟康唑、伏立康唑的敏感率分别为86.4%、90.9%；西弗念珠菌对氟康唑、伏立康唑的MIC值明显高于近平滑念珠菌和白色念珠菌。3种常见的念珠菌对两性霉素B、5-氟胞嘧啶和伊曲康唑均显示较低的MIC值。见表5。

表5 常见念珠菌对于常用抗真菌药物的敏感率及MIC50/MIC90/MIC分布范围

2.2.4常见丝状真菌的药物敏感性分析 目前CLSI尚未建立丝状真菌对于常用抗真菌药物的临床折点，因此无法直接判断敏感性。黄曲霉、土曲霉对于两性霉素B具有较高的MIC值；聚多曲霉、黑曲霉、烟曲霉对于两性霉素B的MIC值较低。聚多曲霉、黄曲霉、土曲霉、黑曲霉以及烟曲霉对于伏立康唑均具有较低的MIC值。见表6。

表6 常见丝状真菌对两性霉素B、伏立康唑的MIC50、MIC90、MIC分布范围(μg/mL)

3 讨 论

CSOM作为耳鼻喉科常见的一种慢性疾病，是导致患者听力损失的一个重要原因[3]，严重影响患者的生活质量，甚至威胁患者的生命。根据临床表现的差异，可以将其分为单纯型、骨疡型和胆脂瘤型中耳炎。胆脂瘤型中耳炎是其中较为严重的一种类型[7]，胆脂瘤可不断向周围扩张，破坏周围骨质、血管及神经[8-9]。CSOM的发生及发展过程都与微生物的关系密切。抗菌药物的局部或者全身使用是治疗CSOM的一种重要手段[10]。由于病原学检测耗时长，灵敏度低，导致临床治疗过程中通常需要进行经验性的抗菌药物治疗。经验性治疗过程中抗菌药物选择的重要依据是当地的病原学流行数据，因此，了解当地病原体的菌种分布及耐药性监测的流行病学数据对于CSOM的治疗具有重要的意义。

本研究结果显示，在CSOM患者中常见的细菌是金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、铜绿假单胞菌及奇异变形杆菌，与国内外的研究报道一致[11-13]。胆脂瘤型患者中铜绿假单胞菌及肠杆菌科细菌检出率较高，与目前国内的研究报道结果相同[11,13]。原因可能与铜绿假单胞菌及肠杆菌科细菌中的奇异变形杆菌毒力较强，对于病灶周边的破坏力更强有关；另一个更为主要的原因可能与铜绿假单胞菌等所引起的连锁免疫应答反应有关[11]。铜绿假单胞菌、奇异变形杆菌等细菌与胆脂瘤型之间的关系需要进一步的研究。

本研究中真菌的检出率远高于国内其他地区的报道[1]；曲霉菌在所有的病原体中检出率排名第1，在非胆脂瘤型患者中的检出率明显高于胆脂瘤型患者。CSOM合并真菌感染患者主要临床表现是耳痛、耳鸣、脓性分泌等，时间久可导致病理性变化，能够破坏中耳的解剖结构，使听力下降，甚至可发生耳漏和颅内并发症[14]。可能原因：华南地区气候温暖潮湿，环境中真菌的载量高，人群暴露于真菌的概率高；外耳道局部环境温暖湿润，适宜真菌生长；CSOM患者病程长，治疗过程中广谱抗菌药物及糖皮质激素的广泛应用；人口老龄化、糖尿病等消耗性疾病患者的增加。由于真菌在实验室培养过程中阳性率低，污染率高，因此，除了进行真菌培养以外，必须重视真菌涂片镜检。将涂片镜检和真菌培养两种方法结合，可以明显提高真菌的检出率。

在本研究中分离出的前3位的真菌分别是近平滑念珠菌、聚多曲霉和黄曲霉，与人体其他部位分离的真菌种类明显不同[15]。需要指出的是，本实验室2015—2019年分离的聚多曲霉和西弗念珠菌均来源于CSOM患者的耳道分泌物。这2种真菌与CSOM疾病发生、发展过程中的关系以及从耳道分泌物中分离到的原因，目前尚不清楚，需要进一步的研究。

本研究药物敏感性统计结果显示，金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌对于万古霉素、利奈唑胺、替考拉宁的敏感率为100.0%，除对青霉素G、红霉素的敏感率较低外，对于喹诺酮类、四环素类、氨基糖苷类药物的敏感率均高于70.0%；铜绿假单胞菌对第三、四代头孢，庆大霉素，妥布霉素，碳青霉烯类及喹诺酮类药物均具有较高的敏感率；除西弗念珠菌对于氟康唑、伏立康唑具有较高的MIC值以外，其他的念珠菌对于氟康唑、伏立康唑、两性霉素B、5-氟胞嘧啶和伊曲康唑均具有较高的敏感率或者较低的MIC值；除橘青霉以外的常见丝状真菌对于伏立康唑均具有较低的MIC值，除黄曲霉、土曲霉对于两性霉素B的MIC值较高以外，其余常见丝状真菌对于两性霉素B具有较低的MIC值。本研究的不足之处在于，由于实验条件限制，未进行酮康唑、特比萘芬等局部常用抗真菌药物的药物敏感性检测，将在后续的工作中进一步完善。

综上所述，广东省CSOM患者中常见病原体的种类与国内其他地区的报道一致，以葡萄球菌、铜绿假单胞菌、念珠菌和曲霉菌为主，但是真菌的检出率明显高于国内其他地区。检出的主要细菌对于常用的抗菌药物，如喹诺酮类仍然具有较高的敏感性。