蒙古马马胃蝇幼虫形态学及线粒体基因的研究

董俊斌 ， 包海泉

(1.内蒙古农业大学兽医学院 , 内蒙古 呼和浩特 010018 ;2. 内蒙古农业大学食品科学与工程学院 ， 内蒙古 呼和浩特 010018)

马胃蝇广泛分布于世界各地,其幼虫在动物消化道中发育，能引起长鼻目(Proboscidea),犀科(Rhinocerotidae)，马科(Equidae)动物的寄生虫病[1]。马胃蝇幼虫长期寄生于动物的消化系统内，引起消化系统疾病。临床上表现为胃溃疡、胃肠壁穿孔、肠阻塞、肠扭转、腹泻，严重的会出现贫血，最后死亡[2]。马胃蝇在分类学上属于双翅目(Diptera)，胃蝇科(Gasterophilidae)，胃蝇属(Gasterophilus)。我国目前报道的马胃蝇有7种，包括肠胃蝇(G.intestinalis)、鼻胃蝇(G.nasalis)、黑角胃蝇(G.nigricornis)、裸节胃蝇(G.imermis)、红尾胃蝇(G.haemorrhoidalis)、黑腹胃蝇(G.pecorum)和Gasterophilusflavipes[3-5]。除了上述几种，全世界流行的胃蝇还有扁腹胃蝇(G.lativentris)、南方胃蝇(G.meridionalis)和三列棘胃蝇(G.ternicinctus)[3]。

马胃蝇线粒体基因在研究马胃蝇分类和种属鉴定上应用越来越广泛。马胃蝇线粒体基因大小一般在14～20 kDa,是闭合双链DNA结构，线粒体基因组上的多数基因在J链上编码，少数基因在N链上编码。其中稳定的包含有13个编码蛋白，细胞色素氧化酶亚基(COXⅡ)是13个编码基因中的一员。还包括22个tRNA 基因、2个rRNA基因(16S rRNA和12S rRNA)[6]。16S核糖体rRNA简称16S rRNA，是原核生物的核糖体中30S亚基的组成部分。

近年来有学者对伊犁马、普氏野马胃蝇蛆病进行了报道，对于蒙古马马胃蝇的研究在国内外还很少，对其病原形态和分子生物学还不太明确。因此，本试验选取了蒙古马马胃蝇幼虫进行形态学试验，并对蒙古马马胃蝇线粒体基因COXⅡ、16S rRNA进行序列分析，为探讨蒙古马的马胃蝇分子生物学机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 蒙古马马胃蝇幼虫样品采集 2019年1月在内蒙古呼和浩特市四子王旗收集感染马胃蝇的马匹8匹，剖检以后获取马胃蝇幼虫。将虫体置于平皿内放于解剖镜下观察。

1.2 形态学观察 对蒙古马马胃蝇三龄幼虫进行扫描电镜HITACHI S3400 SEM (Hitachi Corp.,Tokyo,Japan)、光学显微镜(Olympus Corp.,Tokyo,Japan)观察。电镜扫描标本、光镜样本按照常规处理方法处理。

1.3 虫体基因COXⅡ、16S rRNA的扩增及分析 取马胃蝇三龄幼虫冷冻样品约100 mg，通过干燥(60 ℃下干燥15 min)、液氮研磨,试剂盒法(Quantum Prep,AquaPure Genomic DNA Kit,Bio-Rad)提取总DNA。PCR 扩增线粒体基因COXⅡ、16S rRNA目的基因。PCR引物的选择参照文献[7-8]设计的昆虫线粒体COXⅡ、16S rRNA基因引物(表1)。

表1 线粒体细胞色素氧化酶亚基COXⅡ基因和16S rRNA 基因引物Table 1 Primers for mitochondrial cytochrome oxidase subunit (COXⅡ) gene and 16S rRNA gene

用Clustal W软件进行多序列比对和分析[9]。利用MEGA 6.0软件对马胃蝇COXⅡ基因、16S rRNA基因与GenBank数据库中胃蝇属的其他种类同源序列进行比较并构建系统发育树。

2 结果

2.1 形态学观察 解剖镜观察到一龄、二龄、三龄蒙古马马胃蝇幼虫呈深红色，头部尖，尾部较钝(图1)。一龄幼虫约长7.8 mm，宽3.2 mm。二龄幼虫长约长12.4 mm，宽5. 7 mm。三龄幼虫约长20.5 mm，宽7.1 mm。所有的幼虫由12个体节组成(1个头节，3个胸节，8个腹节)，1、2体节各有1排棘刺，每排大约有35～42个棘刺。从第3节开始棘刺呈双排，外排棘刺大于内排棘刺。第6、7、8体节棘刺大而密集，每排大约有60～75个棘刺。从第1体节直至第8体节，没有中断。第9体节几乎没有棘刺(图1A)。一龄幼虫和二龄幼虫虫体领部棘刺，伪头小齿,体节的棘刺，底部宽、刺尖细；三龄幼虫虫体领部棘刺，伪头小齿，体节的棘刺，尖部变得更细，刺的结构刀状刺底部较宽，刺尖部窄(图1B、1C)。

图1 蒙古马马胃蝇幼虫形态Fig.1 Morphology of Mongolian horse Gasterophilus sp. larvaeA:马胃蝇一龄、二龄、三龄幼虫背部解剖镜图(40×)； B:三龄幼虫头部光镜图(40×)； C：三龄幼虫头部电镜图； D：三龄幼虫后气门板光镜图(40×)。 mh：口沟； pas：乳突状感受器； oc：口脊骨; ns：颈部棘刺； dsp：伪头小齿； so：后气门板上气门孔裂缝A:Anatomical mirror image of the back of the first,second and third instar larva(40×); B:Light micrographs of a third instar larvae of Mongolian horse Gasterophilus sp.(40×); C:Scanning electron micrographs of a third instar larvae of Mongolian horse Gasterophilus sp.； D:Light micrographs of the posterior spiracular discs in a third instar larvae of Mongolian horse Gasterophilus sp.(40×).mh:Mouthhook; pas:Papillary sensilla; oc：Oral cristae; ns:Neck spines; dsp:Dorsal spines in the pseudocephalon; so：Spiracular openings

光镜观察一龄、二龄、三龄幼虫的头部，发现有1对口钩、1对乳突状感受器和1对口脊骨。尾部有1对后气门板(表2)。

表2 蒙古马马胃蝇一、二、三龄幼虫形态比较Table 2 Morphology of Mongolian horse Gasterophilus sp.larvae (μm)

三龄幼虫口脊骨叶部顶端为平滑状(图1C)，扫描电镜观察头部口钩表面较光滑，无纤毛类结构，口钩的底部较粗大。在口钩与感受器之间有伪头小齿，底部较宽，刺尖部窄(图1B、1C)。尾部有1对呈“D”形的后气门板(图1D)。蒙古马马胃蝇三龄幼虫棘刺形态、背脊的连续性、口脊页部形态、伪头小刺的结构与其他流行的胃蝇形态比较见表3。

表3 胃蝇属三期幼虫形态学比较Table 3 Morphological comparison of three-stage larvae of Gasterophilus sp.

2．2 蒙古马马胃蝇COXⅡ基因、16S rRNA扩增 蒙古马的马胃蝇线粒体细胞色素氧化酶亚基(COXⅡ)基因核酸序列利用引物扩增出 668 bp的条带，16S rRNA基因核酸序列利用引物扩增出482 bp的条带。

本试验中，马胃蝇线粒体COXⅡ基因和16S rRNA基因分别与GenBank中的5种胃蝇属或与胃蝇属相近的皮蝇属、黄蝇属、狂蝇属的线粒体COXⅡ基因、16S rRNA基因，利用Clustar W对齐。线粒体COXⅡ基因分别与肠胃蝇Gasterophilusintestinalis(NC_029834)、黑腹胃蝇Gasterophiluspecorum(NC_029812)、皮蝇属的皮蝇Hypodermalineatum(NC_013932)、黄蝇属的Dermatobiahomini(NC_006378)和狂蝇属的羊狂蝇Oestrusovis(KR820748)进行比对。线粒体16S rRNA基因分别与胃蝇属的肠胃蝇Gasterophilusintestinalis(KR230430)、胃蝇Gasterophilushamorrhoidalis(AF322439)、皮蝇属的皮蝇Hypodermasinense(EU276096)、皮蝇Hypodermadiana(AF322438)、狂蝇属的Cephenemyiastimulator进行比对。

比对结果发现，蒙古马马胃蝇COXⅡ基因对齐以后400个位点中，A、T、C、G的平均含量分别为33.33%、35.57%、18.11%和13.00%。A+T含量偏高，为68.9%。A+T含量在第3位点最高，达到78.60%，具有偏向性。核苷酸序列碱基保守位点152个、变异位点516个、简约信息位点131个、自裔位点385个。16S rRNA基因核酸序列对齐452 bp中，A、T、C、G的平均含量分别为34.54%、37.64%、10.73%和17.09%。A+T含量偏高，为72.38%。A+T含量在第3位点最高,达到71.70%，具有偏向性。核苷酸序列碱基保守位点198个、变异位点275个、简约信息位点58个、自裔位点215个。

对于线粒体COXⅡ基因利用最大似然法构建系统发育树(图2)。整体转换/颠换(TS/TV)(R=1.236)。最大似然法的进化历史基于GTR模型(General time reversible model)[9]。进化树最高的对数(Log likelihood)可能性为-3 222.676 0。分支附近和分类群连在一起显示的是进化树的百分率。进化树分析包括6个核酸序列，核酸位置包括第1位点、第2位点、第3位点和非编码区,总共包括620个核酸位置，利用MEGA 6.0软件构建系统发育树。

图2 线粒体细胞色素氧化酶亚基(COXⅡ)基因利用最大似然法构建系统发育树Fig.2 Molecular phylogenetic analysis of COXⅡ gene by maximum likelihood method

对于16S rRNA基因，利用最大似然法构建系统发育树(图3)。整体转换/颠换(TS/TV)(R=6.205)。最大似然法的进化历史基于GTR模型。进化树最高的对数(Log likelihood)可能性为-1 529.139 3。分支附近和分类群连在一起显示的是进化树的百分率。进化树分析包括6个核酸序列，核酸位置包括第1位点、第2位点、第3位点和非编码区，总共包括452个核酸位置，进化树利用MEGA 6.0软件设计。

图3 16S Ribosomal RNA基因利用最大似然法构建系统发育树Fig.3 Molecular phylogenetic analysis of 16S rRNA gene by maximum likelihood method

线粒体COXⅡ基因使用聚类分析发现，肠胃蝇和黑腹胃蝇首先聚在一起后与人皮蝇聚在一起，然后与纹皮蝇、羊狂蝇聚在一起，最后与本试验的蒙古马马胃蝇聚集在一起。蒙古马马胃蝇与之前报道过的肠胃蝇、黑腹胃蝇、人皮蝇、纹皮蝇、羊狂蝇相比在不同的进化树分支上。线粒体16S rRNA基因使用聚类分析发现，肠胃蝇Gasterophilusintestinalis、红尾胃蝇Gasterophilushamorrhoidalis、皮蝇属的Hypodermadiana先聚在一起，狂蝇属的Cephenemyiastimulator和皮蝇属的Hypodermasinense先聚在一起，最后与本试验的蒙古马马胃蝇聚集在一起。蒙古马马胃蝇与之前报道过的肠胃蝇、黑腹胃蝇、人皮蝇、纹皮蝇、羊狂蝇在不同的进化树分支上。

3 讨论

本试验描述了蒙古马马胃蝇幼虫在头部有1对乳突状感受器，对蒙古马马胃蝇领部棘刺，体节上的棘刺以及伪头小齿进行了形态描述，这些特征丰富了Zumpt[11]在1965年对马胃蝇形态的描述。2004年Sukontason等[10]认为，前胸、中胸以及体节的棘刺的形态特征是非常重要的，他们的形态特征是医疗上寄生昆虫种类的鉴定标准。Sukontason等[10]还描述了能够引起疾病的蝇类三龄幼虫都具有刺底部较宽，刺尖部窄的特征。本试验结果(表3)显示，蒙古马马胃蝇幼虫棘刺的底部较宽，刺尖部窄，这种特征和黑腹胃蝇、肠胃蝇、鼻胃蝇、裸节胃蝇幼虫的棘刺相似[10]。Zumpt[11]认为，三龄幼虫体节背脊上的刺是鉴定马蝇种类最重要的特征。蒙古马马胃蝇的L1幼虫和L2幼虫底部宽、刺尖细，L3幼虫的刺的尖部变得更细，刺的结构刀状，这与Dasilvaxavier等[12]在2016报道的双翅目Sarcophagidae的幼虫形态相似。

本试验观察到的马胃蝇的第1、2体节各有1排棘刺，从第3体节开始棘刺呈双排，体节上的背部棘刺从第1体节直至到第8体节，没有中断，到第9体节几乎没有棘刺，而杨红霞等[4]对兽胃蝇蛆、鼻胃蝇蛆、红尾胃蝇蛆、肠胃蝇蛆4种胃蝇的研究指出：鼻胃蝇三期幼虫形态特征为单排刺列,但在其胸部第1刺列为双排刺；兽胃蝇(又称黑腹胃蝇)背面刺带直至第6腹节；肠胃蝇背面刺带直至第7腹节，第2胸节的中间小刺明显中断；红尾胃蝇背面刺带直至第6腹节，在第2胸节中间棘刺中断明显，这些与本试验结果存在明显差异。刘善辉[13]在研究中指出，黑腹胃蝇棘刺在背部第7、8体节中断，第3体节棘刺呈单排。这与本试验结果也不相同(表3)。

本试验结果(表3)显示，蒙古马胃蝇三龄幼虫口脊骨页部形态、伪头小刺结构与黑腹胃蝇三龄幼虫的形态特征相似。杨红霞等[4]在研究中指出，红尾胃蝇、鼻胃蝇与肠胃蝇这3种三龄幼虫的口脊页部的顶端部位与黑腹胃蝇的不同，呈锯齿状，而黑腹胃蝇口脊骨叶部顶端为平滑状[4]，伪头小齿是黑腹胃蝇三期幼虫的特征性结构。蒙古马马胃蝇幼虫的口钩，乳突状感受器的形态与脑民塔拉[14]对于蒙古马马鼻蝇蛆的研究观察到的形态相似，但是马胃蝇后气门板的形态与脑民塔拉观察到的马鼻狂蝇的后气门板形态、大小不同。本试验中蒙古马马胃蝇三龄幼虫的后气孔气门板上有6个开口，气门肌肉使得气门板上的开口形态垂直。2012年Mendonça等[15]报道双翅目金蝇属麻蝇科Chrysomya.putoriaWiedemann在后气门板上也有类似垂直的后气门裂缝。马胃蝇的种属鉴定从形态上来区分比较困难、复杂[16]。因此需要分子学的相关知识进行种属鉴定。

马胃蝇线粒体基因对于群体遗传学、系统发育学、系统分类学意义重大，线粒体基因可以作为标记基因。2018年Zhang等[17]报道由于地理环境和生活环境的影响，中国与意大利报道的同种类的黑腹胃蝇、肠胃蝇、鼻胃蝇、黑角胃蝇的线粒体基因序列存在基因变异。刘善辉[13]对新疆普氏野马马胃蝇进行线粒体基因分析得出在新疆主要有6种胃蝇：肠胃蝇、鼻胃蝇、黑腹胃蝇、黑角胃蝇、裸节胃蝇和红尾胃蝇。2019年Li等[5]通过对新疆目前流行的胃蝇进行线粒体基因研究又发现1种名为G.flavipes的胃蝇。

马胃蝇呈全世界分布，内蒙古自治区分布着120多万匹蒙古马,数量约占全国马匹总数的1/5。本课题组从2015年以来研究马蝇蛆病，经调查发现，马胃蝇蛆病流行于内蒙古自治区的呼伦贝尔、呼和浩特、赤峰、鄂尔多斯、锡林郭勒盟等地，发病率在8%～10%，病死率为80%左右。目前，许多胃蝇科昆虫的线粒体基因报道还不全面[18]。在GenBank数据库中能够查到的不同种属胃蝇的线粒体基因序列非常少。通过系统发育树分析发现，蒙古马马胃蝇的线粒体COXⅡ基因、16S rRNA基因与GenBank数据库中狂蝇属、黄蝇属、胃蝇属和皮蝇属的昆虫在系统发育树中分开，有一定遗传距离。

4 结论

形态学结果说明，蒙古马马胃蝇三龄幼虫领部棘刺，体节上的棘刺形态，口脊骨页部形态和伪头小刺结构与黑腹胃蝇三龄幼虫的特征相似。分子生物学研究说明，蒙古马马胃蝇线粒体基因COXⅡ和16S rRNA与GenBank报道的胃蝇属(肠胃蝇、黑腹胃蝇和红尾胃蝇)都有一定的遗传距离，且与黄蝇属、皮蝇属、狂蝇属分开，单独成1个分支。可知，蒙古马马胃蝇形态上与黑腹胃蝇相似，但是线粒体基因存在变异，可能代表马胃蝇的一个新变种。