长白山红景天黄酮组分的提取工艺及抗炎作用

马莹慧 ， 熊 馨 ， 李 月 ， 于美娜 ， 矫艳磊 ， 雷玉敏 ， 时念秋

(吉林医药学院药学院 , 吉林 吉林 132013)

长白山红景天(Rhodiolasachalinensis)，又称库页红景天，为多年生草本植物，主要生长于我国吉林长白山及黑龙江等地区，是一种药食兼用的珍贵植物。现代医学研究表明，红景天黄酮类化合物具有抗氧化、抑制肿瘤、预防心血管疾病等多种药理作用，被广泛应用于保健食品开发中[1-4]。随着不断的研究与发现,红景天中黄酮类化合物被证明在某些药理活性方面优于多糖类等组分[5-6]。本试验通过对长白山红景天中黄酮类成分进行提取和纯化，并对其抗炎及抗氧化活性进行研究，为今后进一步研究、开发和利用长白山红景天这一珍贵资源提供了科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器与设备 多功能中药粉碎机(旭郎机械公司)；数控超声波清洗器(固特超声仪器有限公司)；Rotavapor R-3旋转蒸发仪(瑞士步琦有限公司)；Scientz-12SN冷冻干燥机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；UV-1800型紫外分光光度计(上海奥析科学仪器有限公司)；酶标仪(美国伯乐公司)；Heal Force HF90/HF240 CO2培养箱(上海力新仪器有限公司)；倒置显微镜(南京麦迪森仪器有限公司)；恒温水浴锅(上海汗诺仪器有限公司)；ESJ200-4B电子分析天平(沈阳龙腾电子有限公司)。

1.1.2 药品与试剂 长白山红景天中药饮片(酒泉市培丰中药材生态种植加工有限公司，批号：170801)；DMEM高糖培养基(美国Gibco公司，批号：8118069)；胎牛血清(美国Clark Bioscience公司，批号：JC53519)；青霉素、链霉素双抗液(美国MRC公司，批号：SK171106)；胰蛋白酶(美国MRC公司，批号:TC71010)；噻唑蓝(MTT，美国Sigma公司，批号：0973)；磷酸盐平衡盐缓冲溶液(PBS，pH=7.2，美国HyClone公司，批号:AC11271276)；二甲基亚砜(DMSO,美国Solarbio公司，批号:1213C0214)；小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞(购自上海赛库生物技术有限公司)；甲醇(分析纯；江苏汉邦科技有限公司)；芦丁(上海源叶生物科技有限公司)；AB-8型树脂(东鸿化工有限公司)；TNF-α、IL-10试剂盒(上海康朗生物科技有限公司)、脂多糖(LPS，美国Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 标准曲线的绘制 以芦丁为对照品，采用亚硝酸钠-硝酸铝比色法测定总黄酮含量。精密称5 mg芦丁对照品置于容量瓶中，以50%乙醇定容至5 mL，配制成浓度为1 mg/mL的对照品溶液。分别取0.2、0.3、0.4、0.5、0.7 mL和0.9 mL至于试管中，用50%乙醇补足体积均为1 mL，各管中加5%亚硝酸钠溶液0.2 mL，摇匀。静置6 min后，加10%硝酸铝溶液0.2 mL，摇匀。静置6 min后，加4%氢氧化钠溶液1 mL，用50%乙醇补足体积至10 mL，摇匀。静置15 min后，在510 nm波长下，以50%乙醇为参比测定各管中药液的吸光度值。以药品浓度(X)—吸光度值(Y)进行线性回归，得到芦丁对照品的标准曲线[7-9]。

1.2.2 长白山红景天中黄酮组分的提取 取干燥的长白山红景天药材，用粉碎机粉碎，过40目筛，晾干，称重，设计单因素试验，确定长白山红景天中黄酮类成分最佳提取工艺。精密称定长白山红景天药粉置于乙醇溶液中，超声法进行提取，将超声提取后的药液进行抽滤，旋蒸至50 mL，用75% 乙醇溶液补足损失的体积。从滤液中取出0.2 mL，按照“1.2.1”项下方法测定长白山红景天滤液吸光值，按如下公式计算黄酮得率(c为标准曲线中黄酮的浓度，m为称取的长白山红景天药粉的质量)。

1.2.3 单因素试验 按照“1.2.2”项下方法，对黄酮组分进行提取，分别考察乙醇提取液的体积分数、料液比、超声时间、超声功率、超声温度对黄酮组分提取率的影响[10-12]。各因素水平范围见表1，当考察某单一因素时，其他因素取水平范围的中间值，例如对乙醇提取液的体积分数进行方法优化时，固定料液比1∶25，超声时间35 min，超声温度50 ℃，超声功率150 W，主要考察乙醇的体积分数分别为40%、50%、60%、70%和80%，通过考察不同体积分数对总黄酮提取率的影响，确定乙醇提取液的最佳体积分数。

表1 单因素水平范围Table 1 Single factor level range

1.2.4 正交试验 结合单因素试验数据，选取提取液浓度、料液比、超声时间及超声功率为提取因素，建立四因素三水平的正交试验，对各因素影响的显著性及提取的最佳工艺进行进一步考察[8]。正交试验因素水平见表2。

表2 正交试验因素水平Table 2 Orthogonal test factor level table

1.2.5 长白山红景天黄酮组分的纯化 在室温条件下，将AB-8大孔树脂置于95%乙醇中密封浸泡24 h，用95%乙醇清洗，再用蒸馏水冲洗至流出液无醇味。取适量AB-8大孔树脂和3根型号完全相同的柱子(树脂装柱体积为1 BV)，按照层析柱径高比1∶16、上柱体积流量 2 BV/h、洗脱体积流量2 BV/h的条件进行纯化。

首先，考察上样浓度对AB-8树脂吸附总黄酮效果的影响。取黄酮组分质量浓度分别为0.2、0.1、0.05 、0.03 mg/mL和0.02 mg/mL的药液进行上样，收集经树脂吸附后的溶液，按以下公式计算吸附率(m1为粗提液中总黄酮含量，m2为收集液中总黄酮含量)。

其次，考察最佳上样量。取黄酮组分质量浓度为0.05 mg/mL的药液进行上样，过程中液体流速始终控制为2 BV/h，分段收集，每段收集10 mL，测定流出液中总黄酮含量与同体积粗提液中总黄酮的含量的百分比，绘制吸附泄漏曲线，考察药液的最佳上样量。

最后，考察洗脱剂体积分数及洗脱剂用量。以体积分数分别为40%、50%、60%、70%和80%的乙醇作解吸液，以2 BV/h的流动速度进行洗脱，通过计算洗脱液中黄酮组分的洗脱率，考察洗脱剂体积分数对黄酮组分解吸效果的影响(ma为洗脱液中总黄酮含量，mb为粗提液中总黄酮含量)。

用50%的乙醇溶液进行洗脱，分段收集，每段收集10 mL，测定流出液中黄酮类化合物的浓度，绘制动态洗脱曲线，对洗脱剂最适用量进行考察[13-18]。

1.2.6 长白山红景天黄酮组分的体外抗炎试验

1.2.6.1 长白山红景天黄酮组分对巨噬细胞活性的影响 取对数生长期的RAW 264.7细胞，按2×104个/孔将细胞接种于96孔细胞培养板中，放入37 ℃ CO2培养箱中培养48 h。试验设空白对照组和不同浓度的样品组，空白对照组加入培养基200 μL，样品组分别加入黄酮化合物终浓度为 2、4、6、8、10、20、30、40 mg/mL和60 mg/mL的培养基0.2 mL，设5个复孔。培养箱中培养2.5 h后吸弃各孔上清液，加入100 μL质量浓度为1.0 mg/mL的MTT，继续培养4 h。移除MTT，加入DMSO 0.1 mL/孔，摇床摇晃5～10 min，于570 nm处测定各孔吸光度值，计算细胞存活率(A为不同浓度待测样品吸光度值，A0为样品溶液吸光度值)。

1.2.6.2 长白山红景天黄酮组分对细胞因子TNF-α、IL-10表达的影响 按3×105个/孔将小鼠巨噬细胞接种于 6 孔细胞培养板，每孔200 μL。设空白对照组(培养液2 mL)、LPS模型组(含终浓度为10 μg/mL LPS 的培养液2 mL) 和黄酮组(含终浓度为4 mg/mL黄酮+10 μg/mL LPS的培养液2 mL)，每组设置5个复孔，于培养箱中共同处理 24 h。培养结束后收集细胞上清液，按ELISA试剂盒说明书操作，检测细胞因子TNF-α、IL-10 的分泌量[19-22]。

2 结果

2.1 芦丁标准曲线的绘制 将芦丁标准品按照“1.2.1”项下方法进行测定，得到芦丁对照品的标准曲线，其线性回归方程为y=9.011 8x+0.030 6,R2=0.999 1。

2.2 长白山红景天黄酮组分的提取

2.2.1 各因素对黄酮组分提取率的影响 按照“1.2.3”项下方法对长白山红景天黄酮组分进行单因素试验，各单因素试验结果见图1，分析试验结果，确定最佳提取工艺为：乙醇提取液体积分数为60%，料液比为1∶35，提取时间为35 min，提取温度为60 ℃，提取功率为200 W。

图1 各因素对黄酮组分提取率的影响Fig.1 Influence of various factors on extraction rate of flavonoids1、2、3、4、5：各因素的5个条件水平1,2,3,4,5：5 condition levels of each factor

2.2.2 正交试验结果分析 根据单因素试验数据可知，超声温度的曲线较平缓，与其余4种因素相比较，对黄酮组分提取率影响相对较小。因此，选取提取液浓度、料液比、超声时间及超声功率为提取因素，建立L9(34)正交试验，正交试验计划表及结果见表3、表4。

表3 正交试验计划及直观分析Table 3 Orthogonal test plan and visual analysis

表4 正交试验方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal test

根据表中各因素的极差R值大小，分析可知各因素对提取率影响的强弱关系为：乙醇体积分数>料液比>超声时间>超声功率。乙醇体积分数(A)K2>K1>K3，料液比(B)K2>K3>K1，超声时间(C)K3>K1>K2，超声功率(D)K2>K3>K1。根据正交试验结果，确定最佳提取工艺为:乙醇体积分数为60%，料液比为1:35，超声时间为40 min，超声功率为200 W。利用此条件对长白山红景天中黄酮组分进行提取，利用紫外分光光度法测定吸光度值，计算出黄酮组分纯度为69.3%。

2.3 长白山红景天黄酮组分的纯化

2.3.1 上样药液质量浓度对吸附率的影响 按照“1.2.5”项下方法进行试验。当上样药液质量浓度分别为0.02、0.03、0.05、0.10 mg/mL和0.20 mg/mL时，黄酮吸附率分别为32.58%、32.78%、46.74%、46.19%和46.06%，即随着上样药液质量浓度的增加，吸附率呈现先上升后下降的趋势，当药液质量浓度为0.05 mg/mL时，达到峰值，故最佳上样药液质量浓度为0.05 mg/mL。

2.3.2 吸附泄漏曲线的绘制 按照“1.2.5”项下方法对长白山红景天黄酮组分最大上样量进行考察，横坐标用流出液的体积表示，纵坐标用流出液中总黄酮的含量与同体积粗提液中总黄酮的含量的百分比表示，绘制泄漏曲线见图2，由图可知当上样量为2 BV时开始泄漏，故最大上样量为2 BV。

图2 泄漏曲线Fig.2 Leakage curve

2.3.3 洗脱剂体积分数对AB-8树脂解吸总黄酮效果的考察 按照“1.2.5”项下方法对洗脱剂最适体积分数进行考察。当乙醇体积分数分别40%、50%、60%、70%和80%时，黄酮组分洗脱率分别为30.16%、48.22%、22.00%、19.66%和18.56%，故洗脱剂最适浓度为50%。

2.3.4 洗脱剂用量对AB-8树脂解吸总黄酮效果的考察 按照“1.2.5”项下方法对洗脱剂用量进行考察。横坐标用流出液体积表示，纵坐标用黄酮浓度表示，50%的乙醇用量为2.5 BV时，洗脱效果最佳，绘制洗脱曲线见图3。

图3 洗脱曲线Fig.3 Elution curve

最终确定长白山红景天黄酮类成分的最佳纯化工艺为：总黄酮超声提取液上样浓度0.05 mg/mL，最佳上样量为2 BV，乙醇洗脱剂体积分数为50%，洗脱剂体积为2.5 BV，纯化液经冷冻干燥后精密称定冻干粉，利用紫外分光光度计测定黄酮类成分的吸光度值，计算出黄酮成分纯度为81.6%，较纯化前纯度提高了12.3%。

2.4 长白山红景天黄酮组分的体外抗炎试验

2.4.1 长白山红景天黄酮组分对巨噬细胞活性的影响 按照“1.2.6”项下方法进行细胞毒试验，结果见图4。长白山红景天总黄酮浓度在0～4 mg/mL时，对小鼠巨噬细胞无细胞毒性作用，故选择质量浓度为4 mg/mL的总黄酮用于后续试验。

图4 不同质量浓度的总黄酮对小鼠巨噬细胞活性的影响Fig.4 Effect of different mass concentrations of total flavonoids on the activity of mouse macrophages

2.4.2 长白山红景天总黄酮对细胞因子 TNF-α、IL-10表达的影响 通过检测各组细胞培养液中 TNF-α和IL-10的分泌水平，评价长白山红景天黄酮类化合物对 LPS 诱导小鼠巨噬细胞分泌细胞因子含量的影响，其结果见表5。由结果可知，与LPS模型组相比，长白山红景天黄酮组分显著抑制了促炎因子TNF-α的分泌(P<0.01)，促进了抗炎因子IL-10的分泌(P<0.05)，说明长白山红景天黄酮组分具有良好的抗炎作用。

表5 ELISA法测定细胞因子 TNF-α、IL-10的分泌量Table 5 Determination of cytokine TNF-α and IL-10 secretion by ELISA method

3 讨论

红景天作为我国一种传统的草药，具有止血、抗抑郁、治疗腹泻、保护神经等多种功能，具有较高的药用及保健价值[23-27]。其有效成分黄酮组分的提取多采用超声波提取法、有机溶剂提取法及超临界流体萃取法等多种方法。其中超声波提取法具有所需时间短、利用率高、操作方便等优点[28]。本试验通过超声波提取法对长白山红景天黄酮组分进行提取，得出其最佳提取工艺为采用50%乙醇作为提取溶剂，料液比为1∶35,60 ℃、200 W条件下超声提取35 min，提取后黄酮组分纯度为69.3%。黄酮组分的分离纯化方法有多种，其中以大孔吸附树脂进行纯化最为常见，本试验应用AB-8 大孔树脂，按照层析柱径高比为1∶16，药液中黄酮组分浓度为0.05 mg/mL，以2 BV/h的流量速度上样2 BV，再以50%乙醇洗脱2.5 BV的条件对超声波提取后的药液进行纯化，纯化后总黄酮纯度为81.6%，较提取后纯度提高了12.3%，为接下来的研究提供了物质基础。

TNF-α是一种早期炎症因子，是炎症发生过程中的重要介质，可引发一系列炎症；IL-10是一种多功能细胞因子，调节炎症的持续时间和反应过程是其主要生物学功能，同时还具有选择性的阻断促炎性细胞因子以及趋化因子表达的功能，是目前公认的炎症抑制因子[21-22]。长白山红景天中黄酮组分可显著抑制TNF-α的分泌，并且明显提高IL-10的含量，说明具有良好的抗炎活性。本试验主要从细胞水平考察了黄酮组分的体外抗炎作用，为进一步确证，可采用体内动物试验深入研究。