小檗碱抑制TGF-β1通路诱导内脏白色脂肪组织棕色化改善2型糖尿病地鼠脂诱性胰岛素抵抗的研究

刘栩晗，李国生,李欣宇，高政南，黄 澜，刘亚莉

(1. 辽宁省大连市中心医院,辽宁 大连 116033；2. 大连医科大学附属第一医院,辽宁 大连 116011)

内脏白色脂肪组织的过度沉积及相关功能异常是导致2型糖尿病发生的关键因素[1]。胰岛素敏感组织异位脂沉积造成的脂诱性胰岛素抵抗是肥胖2型糖尿病发病的重要推动因素[2]。既往研究表明,小檗碱可通过过氧化物酶体增殖剂激活受体(PPARs)信号通路诱导内脏白色脂肪组织解耦联蛋白(UCP1)表达增加， UCP1增加可耗能散热，增强脂肪细胞脂的原位清除和降血脂的能力[3-6], 但是驱动这个过程的信号通路仍不清楚。因此，本实验主要研究小檗碱对转化生长因子-β1(TGF-β1)信号及白/棕脂肪组织表型特征及特异性基因表达改变的影响,探讨其作为棕色脂肪的诱导剂改善胰岛素抵抗的分子机制。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 60只7周龄SPF级健康金黄地鼠，雌雄各半,体质量110.3～133.9 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2016-0006，普通饲料喂养，血糖(4.16±0.85) mmol/L。

1.2试剂及仪器 日立7600全自动生化分析仪。胰岛素、瘦素、脂联素ELISA试剂盒购自江苏酶免生物科技有限公司。游离脂肪酸检测试剂盒购自英国Randox公司。德国Qiagen公司RNA提取及逆转录试剂盒，美国Bio-rad公司荧光定量试剂盒和荧光定量PCR仪CFX96 Touch，TaKaRa公司HotStarTaqTMDNA聚合酶，美国Promea公司Oligo-dT和RNase inhibitor；美国Sigma公司小檗碱及链脲菌素(STZ)。美国强生公司稳豪One-Touch血糖仪。

1.3实验方法 按照文献[7]建立肥胖胰岛素抵抗和肥胖2型糖尿病地鼠模型。从60只健康地鼠中随机取10只作为对照组，给予普食饲养；余50只给予高脂饮食饲养。饲养4周后，从50只高脂饮食饲养的地鼠中随机取10只腹腔注射40 mg/kg的柠檬酸缓冲液作为胰岛素抵抗组，余40只腹腔注射40 mg/kg(无菌柠檬酸缓冲液配制1% STZ 溶液) STZ进行2型糖尿病造模，各组地鼠继续按腹腔注射前的饮食喂养2周。经口服葡萄糖耐量试验确定29只地鼠2型糖尿病造模成功，从中随机选择10只作为2型糖尿病组，10只作为2型糖尿病小檗碱组。2型糖尿病小檗碱组给予小檗碱150 mg/kg溶于PBS/羧甲基纤维素溶液中灌服，其余3组均灌服同等体积的PBS/羧甲基纤维素溶液，均1次/d，连续9周。实验最后1 d，各组地鼠禁食12 h、禁食9.5 h后称体质量给药，给药后2.5 h处死并留血液标本，迅速分离双侧肾周围脂肪垫、肠系膜脂肪组织、子宫旁或附睾旁脂肪组织并称质量，保存于-80 ℃备用。

1.4观察指标与方法

1.4.1口服葡萄糖耐量试验及胰岛素释放试验实验结束处死动物前按照文献[7]进行口服葡萄糖耐量试验及胰岛素释放试验。

1.4.2生化指标检测 采用稳豪血糖仪检测空腹血糖，日立全自动生化分析仪7600检测血脂[三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和总胆固醇(TC)]水平。按照ELISA试剂盒说明检测血瘦素、胰岛素、脂联素、游离脂肪酸水平。计算胰岛素抵抗指数和胰岛素敏感指数。

1.4.3内脏脂肪质量及内脏脂肪占比 记录各组地鼠双侧肾周围脂肪垫、肠系膜脂肪组织、子宫旁或附睾旁脂肪组织的总重量，计算内脏脂肪占比(内脏脂肪质量/体质量×100%)。

1.4.4内脏脂肪组织中TGF-β1信号通路、白/棕脂肪组织转换通路及其靶基因mRNA表达检测取各组地鼠脂肪组织30 mg，提取总RNA，检测RNA浓度及纯度。根据iQ SYBR Green Mix Kit操作说明书进行目标基因的实时荧光定量PCR检测。PCR检测条件：95 ℃ 3 min, 95 ℃ 10 s 60 ℃ 45 s 45个循环。扩增完成后，应用反应产物的溶解曲线检测其均一性，每个反应重复3次。设立阴性对照，内参基因为β-肌动蛋白(β-actin)。扩增前，每对引物的扩增效率经检测均接近于1。使用 2[-Delta Delta C (T)]方法计算样本目标基因的相对含量[8]。TGF-β1、TβRⅠ、TβR Ⅱ、TβR Ⅲ、母亲DPPT同源物2(Smad2)、Smad3、Smad4、Smad7、Smad泛素化作用相关因子2(Smurf2)、脂肪酸合成酶(FAS)、硬脂酰辅酶A去饱和酶-1(SCD-1)、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、PR结构域蛋白16(PRDM16)、CCAAT增强子结合蛋白β(C/EBPβ)、过氧化物酶体增殖活化受体γ(PPARγ)、过氧化物酶体增殖活化受体γ共激活者1α(PGC1α)、解耦联蛋白1(UCP1)、极长链脂肪酸延长因子3(Elovl3)、CCAAT增强子结合蛋白α(Cebpα)、细胞死亡诱导的DFFA样效应因子a (Cidea)和β肌动蛋白(β-actin)引物序列见表1。各指标结果以相对定量2-ΔΔCt法表示。

1.5统计学方法 使用SPSS 17.0软件进行数据处理。实验数据以均数±标准差表示，多组间比较采用进行单因素方差分析，两两比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1各组地鼠代谢表型和代谢特征比较 与对照组比较，2型糖尿病组和胰岛素抵抗组地鼠体质量、内脏脂肪质量、内脏脂肪占比、空腹血糖、TC、TG、LDL-C、游离脂肪酸、瘦素、胰岛素抵抗指数和口服葡萄糖耐量试验各时间点的血糖水平、葡萄糖曲线下面积均明显增高(P均<0.05)，HDL-C、脂联素、胰岛素敏感指数均明显降低(P均<0.05)；胰岛素释放试验中，胰岛素抵抗组地鼠各时间点的血浆胰岛素水平和胰岛素曲线下面积均明显增高(P均<0.05)，2型糖尿病组30 min、60 min时血浆胰岛素水平均明显降低(P均<0.05)，120 min、180 min时血浆胰岛素水平均明显升高(P均<0.05)。与2型糖尿病组比较，2型糖尿病小檗碱组地鼠体质量、内脏脂肪质量、内脏脂肪占比、空腹血糖、TC、TG、LDL-C、游离脂肪酸、瘦素、胰岛素抵抗指数和口服葡萄糖耐量试验各时间点的血糖水平、葡萄糖曲线下面积均明显降低(P均<0.05)，HDL-C、脂联素、胰岛素敏感指数均明显升高(P均<0.05)；胰岛素释放试验中， 30 min、60 min时血浆胰岛素水平均明显升高(P均<0.05)，120 min、180 min时血浆胰岛素水平均明显降低(P均<0.05)。见表2、表3及表4。

表1 内脏脂肪组织中TGF-β1信号通路、白/棕脂肪组织转换通路及其靶基因荧光定量PCR检测引物

表2 各组地鼠的代谢表型特征指标比较

表3 各组地鼠口服葡萄糖耐量试验血糖比较

表4 各组地鼠胰岛素释放试验指标比较

2.2各组地鼠内脏脂肪组织中TGF-β1通路、白/棕脂肪组织转换通路基因的mRNA表达情况 与对照组比较，2型糖尿病组和胰岛素抵抗组地鼠内脏脂肪组织中TGF-β1、TβRⅠ、TβR Ⅱ、TβR Ⅲ、Smad2、Smad3、Smad4和白色脂肪组织特异基因FAS、ACC、SCD-1 表达明显增加(P均<0.05)，且2型糖尿病组均明显高于胰岛素抵抗组(P均<0.05)；PRDM16、C/EBPβ、PGC1α、PPARγ、Smad7、Smurf2及棕色脂肪组织特异基因UCP1、Elovl3、Cebpα、Cidea表达均明显减少(P均<0.05)，且2型糖尿病组均明显少于胰岛素抵抗组(P均<0.05)。与2型糖尿病组和胰岛素抵抗组比较，2型糖尿病小檗碱组地鼠内脏脂肪组织中TGF-β1、TβRⅠ、TβR Ⅱ、TβR Ⅲ、Smad2、Smad3、Smad4、FAS、ACC、SCD-1表达明显减少(P均<0.05)，PRDM16、C/EBPβ、PGC1α、PPARγ、Smad7、Smurf2及UCP1、Elovl3、Cebpα、Cidea表达明显增加(P均<0.05)。 见表5。

表5 各组2型糖尿病地鼠内脏脂肪组织中TGF-β1通路、白/棕脂组织转换通路基因的mRNA表达情况

3 讨 论

目前极具吸引力的靶向治疗肥胖和2型糖尿病及相关疾病的新策略和新途径是促使白色脂肪棕色化[9]。最近的研究表明,小檗碱治疗糖尿病的机制可能与其激活棕色脂肪促进白/棕色脂肪组织转化有关，但是驱动这个作用的分子机制尚未完全清楚[10-12]。

TGF-β1受体(TβR)主要包括TβRⅠ、TβR Ⅱ、TβR Ⅲ 3个亚型。活化的TGF-β1首先与TβRⅡ结合或被TβR Ⅲ 传递给TβRⅡ，改变成易被TβR I识别的构像而形成TβRⅡ-TGF-β1-TβR I复合物。Smads蛋白是TGF-β1信号通路中细胞内信号转导的中介分子。活化的TβR I特异地识别磷酸化受体调节型Smad2/Smad3。磷酸化的Smad2/Smad3与Smad4共配体形成复合物，然后转位至胞核，调控靶基因。棕色脂肪细胞表达的关键基因PRDM16和PGC1α是Smad3的靶向调节基因。Smad3可直接结合PGC1α的启动子而抑制其表达[13]。而抑制型Smad7可与Smad2/Smad3竞争性结合TβR I，阻断Smad2/Smad3与受体的相互作用，或招募并增强Smurf2等介导的泛素连接酶降解TβR I和Smad2/Smad3蛋白，而减弱TGF-β1信号，从而对Smad介导的经典信号传导起反馈抑制调节的作用[14]。

本研究结果显示，与对照组比较，2型糖尿病组和胰岛素抵抗组地鼠体质量、内脏脂肪质量、内脏脂肪占比、血糖、TC、TG、LDL-C、游离脂肪酸、瘦素、胰岛素抵抗指数和口服葡萄糖耐量试验各时间点的血糖水平、葡萄糖曲线下面积均明显增高，HDL-C、脂联素、胰岛素敏感指数均明显降低；内脏脂肪组织中TGF-β1、TβRⅠ、TβR Ⅱ、TβR Ⅲ、Smad2、Smad3、Smad4和白色脂肪组织特异基因FAS、ACC、SCD-1 表达明显增加，而PRDM16、C/EBPβ、PGC1α、PPARγ、Smad7、Smurf2及棕色脂肪组织特异基因UCP1、Elovl3、Cebpα、Cidea表达明显减少。这显示在模型地鼠内脏脂肪组织中，TGF-β1信号通路活性增强，Smad3表达增加可抑制棕色脂肪细胞关键基因PRDM16和PGC1α的表达，而白色脂肪关键基因FAS、ACC和SCD-1的表达增加可抑制产热耗能并增强储脂，导致内脏脂肪组织脂沉积进一步增加。同时，增加的脂沉积可失活CPT1，造成脂肪酸β-氧化异常[15]。这将增加内脏脂肪组织脂沉积并形成恶性循环，有助于形成脂诱性胰岛素抵抗，内脏脂肪组织脂含量超载，并促进肥胖性2型糖尿病的发生。而小檗碱干预后，上述各指标均明显改善，提示小檗碱可能通过抑制TGF-β1信号通路，从而诱导内脏白色脂肪棕色化基因表型转化，诱导产热耗能效应，减轻内脏脂肪组织脂沉积，从而改善脂诱性胰岛素抵抗。

综上所述， TGF-β1信号通路表达增强可促进白色脂肪组织成脂基因表达而导致2型糖尿病脂诱性胰岛素抵抗的形成和进展。小檗碱治疗可抑制TGF-β1信号通路，诱导棕色脂肪细胞特异性基因表达，实现内脏白色脂肪组织获得棕色脂肪表型，有助于改善脂诱性胰岛素抵抗及内脏脂肪组织功能。因此，TGF-β1信号通路及白/棕脂肪组织转换通路有望成为小檗碱治疗2型糖尿病的分子靶点。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。