基于网络药理学预测痛泻要方治疗炎症性肠病的作用机制

索光喜，胡倘潇，肖天保

（贵州中医药大学研究生院，贵阳 550000）

炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）为累及回肠、直肠、结肠的一种特发性肠道炎症性疾病，包括溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）和克罗恩病（crohn disease，CD）〔1〕，两者主要症状均为腹痛、腹泻，或有便血，目前发病原因及机制尚不明确。西医药物治疗主要以控制肠道炎症为目的，虽然疗效肯定，但需要长期维持治疗，且容易反复发作。炎症性肠病属于中医“泄泻”范畴，中医经典方剂“痛泻要方”已广泛用于治疗炎症性肠病，诸多临床研究显示其疗效显著〔2〕，有实验研究显示痛泻要方可能是通过提高肠道组织的抗氧化能力、调节免疫功能以及调节肠道血流、促进溃疡愈合等发挥作用〔3-5〕。但受制于实验条件限制，目前针对中药治疗机制的研究多处于观察层面，在现有研究中，各方面机制研究较为单一，缺乏整体性认识。随着现代生物化学对中药成分及作用靶点研究的不断完善，根据相关作用靶点来系统预测其作用机制成为可能。因此，基于现有的大量研究数据，通过网络药理技术预测痛泻要方治疗炎症性肠病的作用机制，为临床试验及新药研发提供参考。

1 方法及结果

1.1 痛泻要方中相关成分的查询及筛选通过中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）检索痛泻要方中四味中药（陈皮、白芍、白术、防风）的化学成分，以通用参考指标口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18 为筛选条件，筛选各味中药的有效化学成分，并查询对应的靶点信息。建立药物成分及作用靶点的数据库。剔除重复成分及靶点，共筛选出有效药物成分39 个，其中32 个成分有明确的靶点数据，共涉及125个靶点。见表1。

表1 痛泻要方中药物化学成分及靶点情况

1.2 炎症性肠病相关靶点的收集在GeneCards（www.genecards.org）及OMIM（omim.org）数据库以“inflammatory bowel disease”为搜索词搜索与炎症性肠病相关的疾病靶点，建立疾病靶点数据库。合并后剔除重复靶点，共有5 852 个疾病靶点。

1.3 筛选共有靶点利用R 语言，筛选出药物靶点（125 个）与疾病靶点（5 852 个）的共有靶点（104个），并保存相关共有靶点数据。

1.4 药物成分治疗网络可视化利用R 语言过滤出与共有靶点相关的药物成分，并建立“药物成分-疾病靶点”数据库，将数据库文件导入Cytoscape软件构建“药物成分-疾病靶点”网络，探究“药物成分-疾病靶点”之间的相关性。见图1。痛泻要方中有31 个化学成分可通过作用于炎症性肠病的104个靶点而发挥治疗作用。

图1 “药物成分-疾病靶点”网络

1.5 构建蛋白互作网络（PPI），筛选核心靶点将“药物成分-疾病靶点”数据库文件中的靶点信息导入STRING（string-db.org）网站，构建PPI，根据靶点蛋白之间相互作用的度值大小筛选出核心靶点。见图2。

图2 “药物成分-疾病靶点”PPI与连接节点条形图

图2 中蛋白靶点的连接节点数越多，表示其在生物过程中发挥的作用越大，根据结果显示，“药物成分-疾病靶点”核心蛋白按度值由高至低依次 为：IL6、AKT1、MAPK3、JUN、CASP3、MAPK1、PTGS2、MAPK8、ESR1、HSP90AA1、CAT、CCND1、MMP9、PPARG、MAPK14、CREB1、RELA、AR、CCL2、HMOX1、AHR。由此推断，痛泻要方中的化学成分，可能主要通过影响以上蛋白的表达来干预炎症性肠病的治疗。

1.6 GO 功能分析所谓GO 功能分析是对所有已知基因进行功能分类，通过R 语言，利用bioconductor 上dose 程序将104 个“药物-疾病”共有靶点进行GO 功能分析。见表2。痛泻要方作用于炎症性肠病靶点的基因功能主要集中在氨基结合（amide binding：13 个基因）、核受体活性（nuclear receptor activity：11个基因）、转录因子活性（transcription factor activity：11 个基因）、磷酸酶结合（phosphatase binding：11 个基因）、类固醇激素受体活性（steroid hormone receptor activity：10 个基因）等生物表达功能上。

1.7 KEGG 通路富集分析KEGG 通路是目前人类已知的存在于生物体内的生物信号通路过程，将筛选到的“药物-疾病”共有靶点富集在目前已知的信号通路上，可以进一步了解相关药物成分对生物信号通路的影响。通过R 语言，利用bioconductor 上clusterprofile 程序将“药物-疾病”共有靶点进行KEGG 通路富集，得到20 条通路富集结果，结果显示，前10 条KEGG 通路主要涉及肿瘤坏死因子信号通路、IL-17（白细胞介素-17）信号通路、Toll样受体信号通路等。见表3。

表2 “药物-疾病”共同靶点GO功能分析结果

表3 “药物-疾病”共同靶点KEGG通路富集结果

2 讨论

目前炎症性肠病发病机制仍不明确，西药治疗主要以控制肠道炎症为主，主要包括氨基水杨酸类、激素类和免疫抑制剂3 大类〔6〕。虽然疗效确切，但需要长期用药，且产生的副作用较大。中药痛泻要方出自《丹溪心法》，常用于治疗脾虚肝旺所致的肠鸣腹痛、大便泄泻，疗效确切。大量现代研究表明，痛泻要方可以减轻肠道黏膜的炎症反应，促进肠道黏膜溃疡的愈合〔7〕。但中医药作用机制复杂，目前针对痛泻要方治疗炎症性肠病的机制研究多具有一定的片面性，故结合目前最前沿的现代医学研究成果，从整体角度探讨其作用机制，具有积极意义。

根据本研究结果分析推测：痛泻要方4 味中药中共有31种治疗炎症性肠病的主要活性成分，目前研究表明白芍中的β-谷甾醇能显著抑制结肠缩短，降低结肠炎的严重程度，显著降低炎症因子IL-1（白细胞介素-1）、IL-6（白细胞介素-6）、MCP-1（单核细胞趋化蛋白-1）和相关COX-2（环氧合酶-2）的水平〔8〕。芍药苷可以抑制肠系膜和结肠组织中巨噬细胞的浸润，抑制结肠巨噬细胞中NLRP3蛋白并抑制细胞因子IL-1β 的释放〔9〕。陈皮中的柚皮素能阻断NF-κB 信号通路，减少肠道中产生的氧自由基，修复损伤的组织〔10〕。

在UC 结肠细胞水平研究上，痛泻要方中相关成分通过影响IL6、AKT1、MAPK3、JUN、CASP3、MAPK1、PTGS2、MAPK8、ESR1、HSP90AA1、CAT、CCND1、MMP9、PPARG、MAPK14、CREB1、RELA、AR、CCL2、HMOX1、AHR 的表达来治疗炎症性肠病，相关研究表明IL-6的表达可引起机体产生炎症反应〔11-12〕。AKT 蛋白表达增强，激活NF-κB 等核转录因子，促使产生大量的促炎性细胞因子，诱导或持续炎症，另一方面刺激细胞持续生长，抑制细胞凋亡，增加癌变机会〔13〕。MAPK 蛋白及mRNA 在UC中表达均有显著升高（P＜0.01），提示炎症因子大量产生，从而形成肠道炎症表现〔14〕。重症UC 患者血清NLRP3、CASP1 和NF-κB mRNA 表达水平均显著升高，且NLRP3 mRNA 与CASP1、NF-κB mRNA 表达呈正相关〔15〕。

GO 功能分析结果显示，痛泻要方中治疗炎症性肠病的104个靶点基因的富集生物学功能主要涉及转录调控、表达以及药物反应等过程，反映出痛泻要方作用于细胞的生物过程也是多样化的。KEGG 通路富集分析表明，痛泻要方治疗炎症性肠病的靶点通路主要涉及肿瘤坏死因子信号通路、IL-17信号通路，Toll样受体等途径。众多研究表明TNF-α（肿瘤坏死因子-α）是重要的炎症启动因子，主要由单核巨噬细胞产生，通过表达凝血因子、成纤维增殖因子和黏附因子以及启动细胞急性反应、凋亡等过程发挥作用〔16〕。而IL-17则可能是通过促进白细胞释放过量的化学因子引起组织炎症的发生，最终强化了肠道内的炎性反应而导致炎症性肠病的形成〔17〕。Toll 样受体（TLRs）∕NF-κB 信号传导通路参与了UC 发病机制，在调节涉及黏膜炎症反应中起核心作用〔18〕。现代研究认为p53信号通路多与癌变相关，提示痛泻要方可能通过影响p53 信号通路抑制UC 癌变。此外KEGG 结果显示痛泻要方还可以通过影响乙肝感染、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、糖尿病并发症中的AGE-RAGE受体信号通路、丙肝感染等通路治疗炎症性肠病，这些信号通路在炎症性肠病的临床研究中少被提及，或许可以成为新的研究方向。

综上，在相关文献研究的基础上结合网络药理学分析，可推测痛泻要方是通过调节炎症通路及干预炎症的发展过程来发挥抗炎症性肠病的作用。本研究为探索痛泻要方的作用机制提供了新的方法和思路，也为下一步实验研究以及有效药物成分的开发提供一些参考。