低聚原花青素对过度训练大鼠骨骼肌损伤的保护作用机制

周海涛，曹建民，胡 戈，牛衍龙，龚 平，邵芙蓉，张子坤，黄景宣，董爱霞

(1.北京联合大学生物化学工程学院，中国北京100023；2.北京联合大学生物活性物质与功能食品北京市重点实验室，中国北京100191；3.北京体育大学运动人体科学学院，中国北京100084；4.常州大学，中国江苏常州213164；5.赣南医学院，中国江西赣州341000)

研究表明，长时程、大强度运动可诱发过度训练及运动性骨骼肌损伤[1～2]。氧化应激是过度训练致骨骼肌损伤及运动能力下降的关键因素[3～4]。丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号系统在机体对环境应激适应及维持内部环境氧化/抗氧化动态平衡中发挥着重要作用。其中，p38 MAPK信号与运动及运动引发和加剧的氧化应激及骨骼肌损伤密切相关[5～6]。研究证实，长时程、大强度运动引发的过度训练使得机体氧化应激反应加剧，自由基在体内过度堆积，MAPK系统活化，进而对骨骼肌功能造成损伤[1，7]。

原花青素(proanthocyanidins，PC)是蔬菜和水果中广泛存在的一大类多酚类化合物的总称，其低聚物——低聚原花青素(oligomerized proanthocyanidins，OPC)是目前国际上公认的天然抗氧化剂，可以高效清除机体内过量堆积的自由基，提高抗氧化酶活性，有效地拮抗大强度运动诱导的氧化应激，保护机体结构/功能[8]。但OPC能否通过调控MAPK信号通路相关蛋白质表达预防和延缓过度训练大鼠骨骼肌损伤的相关研究尚未见报道。本研究以42 d递增负荷跑台训练建立过度训练致运动性骨骼肌损伤动物模型，期间以OPC进行营养干预，通过观察大鼠骨骼肌组织形态，检测过度训练和骨骼肌损伤标志物及骨骼肌氧化应激水平、p38 MAPK信号通路相关蛋白质表达，探讨了OPC改善过度训练致运动性骨骼肌损伤的作用机制，发现OPC可通过改善氧化应激，调控p38 MAPK信号通路相关蛋白质表达，保护过度训练大鼠骨骼肌结构/功能，这将为运动性骨骼肌损伤的防控提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

65只7周龄无特定病原体(specific pathogen free，SPF)级 Wistar大鼠(雄性)源自北京大学医学部实验动物科学部，动物生产合格证编号:SCXK(京)2016-0010，平均体重为(250.1±13.9)g。实验过程中，室内温度保持在(22±2)℃，相对湿度控制在55%～75%，自然光照。所有实验大鼠均在北京体育大学SPF级屏障系统(SYXK京2016-033)以基础饲料[斯贝福(北京)生物技术有限公司，SCXK(京)2019-0010]和蒸馏水常规饲养，自由饮食。

1.2 药物与试剂

OPC，纯度≥95%，低聚体10%～45%(西安通泽生物科技有限公司)；丙二醛(malondialdehyde，MDA)硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)法试剂盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)羟胺法试剂盒(南京建成生物工程研究所)；3-硝基酪氨酸(3-nitrotyrosine，3-NT)、8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxy-2-deoxyguanosine，8-OHdG)酶联免疫试剂盒(上海迪奥生物科技有限公司)；睾酮(testosterone，T)和皮质酮(corticosterone，Cor)放射免疫试剂盒(北京华英生物技术研究所)；p38/p-p38 MAPK抗体(Sigma公司，美国)。

OPC以蒸馏水配制为30 mg/mL的溶液，4℃冰箱避光冷藏待用。

1.3 仪器

DSPT-202型动物跑台(杭州段氏制造厂)，ISO9001型电子天秤(北京赛多利斯仪器系统有限公司)，NR-B17CC型超低温冰箱(日本松下电器产业株式会社)，电动组织匀浆器(美国KIMBLE公司)，5417R低温超速离心机(德国艾本德股份公司)，721紫外可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司)，MultiSkan3 酶标仪(芬兰雷勃公司)，r-911全自动放免计数仪(中国科学技术大学科技实业总公司)，RT2200C全自动生化分析仪(美国雷杜公司)，LEICA RM2016病理切片机(德国RM公司)，Pannoramic MIDI全自动数字切片扫描系统(匈牙利3D HISTECH公司)。

1.4 动物分组

实验大鼠在适应性饲养4 d后，经3 d跑台训练(5 m/min、20 min/d)进行筛选淘汰。将剩余60只大鼠随机分为3组:安静对照组(C组，12只)、过度训练组(OM组，24只)、OPC干预组(OOM组，24 只)。

1.5 过度训练模型建立及营养干预方案

C组不进行任何运动，其他组进行42 d递增负荷跑台训练以建立过度训练模型。具体方案[9～10]见图1。各组大鼠每天于训练前1 h灌胃1次。其中，OOM组根据预实验并参考文献[8]以150 mg/(kg·d)和5 mL/kg的剂量及体积灌胃OPC，其他组灌胃等体积的蒸馏水。

图1 大鼠跑台训练方案[9]从第2周开始，每次训练初始速度为10 m/min，每5 min增加5 m/min，直至本周目标强度。最后1周训练，大鼠若无法维持目标强度，则运动至力竭。Fig.1 Treadmill training program of rats[9]From the second week，the initial speed of each training was 10 m/min，and the speed increased by 5 m/min every 5 min until the target speed of that week was reached.During the last week of training，if the rats could not maintain the target speed，they would exercise to exhaustion.

1.6 取材

受训练强度/频度、疲劳恢复等多重因素影响，实验动物出现意外死亡。实验结束时，OM、OOM组大鼠分别剩余11只和14只。

大鼠末次跑台训练结束后即刻采用2%戊巴比妥钠溶液对其进行麻醉，腹主动脉放血处死。收集全血5 mL，37℃自然凝固，待血清出现后于冰箱4℃存放24 h。4℃、3 000 r/min离心10 min，分离制备血清，并将其置于-20℃冰箱中保存待测。

分离出大鼠两侧完整的比目鱼肌，以4℃的生理盐水进行漂洗，快速去除血液及其他结缔组织，吸干水份后切取右侧组织300 mg，均匀地分为3份，以锡纸包裹标记后装入密封袋，并立即投入液氮中，随后放入-80℃超低温冰箱保存，待测SOD活性以及MDA、3-NT、8-OHdG含量。

切取部分左侧组织，修整为0.5 cm×0.5 cm×1 cm组织块，置入组织固定液中固定24 h后包埋，切片后用于p38 MAPK信号通路相关蛋白质表达水平的免疫组化检测及骨骼肌组织病理变化的HE染色和观察。

1.7 相关指标检测

400倍光学显微镜下进行骨骼肌组织形态学观察。骨骼肌SOD活性采用羟胺法测定，MDA含量采用TBA法测定，3-NT和8-OHdG含量采用酶联免疫吸附测试法测定，血清肌酸激酶(creatine kinase，CK)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)活性采用全自动生化分析仪测定，血清T和Cor采用放射免疫法测定。

p38-MAPK及p-p38 MAPK的蛋白质表达水平采用免疫组化法测定:石蜡切片经梯度乙醇脱蜡后进行抗原修复，加入3%过氧化氢溶液阻断内源性过氧化物酶，使用牛血清蛋白室温封闭30 min，加入一抗(稀释比1︰100)4℃孵育过夜，清洗后加入二抗室温孵育50 min，再次清洗后采用二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)显色，苏木素复染，最后脱水封片。采用数字病理切片扫描仪对每张切片进行全视野数字扫描，细胞核染色为深棕色、棕黄色、浅黄色和蓝色时分别对应强阳性、中度阳性、弱阳性和阴性，对阳性细胞数量及染色强度进行分析记录，识别出阳性细胞面积，应用公式计算H-score以便定量分析[11]。H-score=(强阳性细胞密度×3)+(中度阳性细胞密度×2)+(弱阳性细胞密度×1)。

1.8 数据统计

采用SPSS 22.0软件对所有数据进行处理，数据以平均值±标准差(±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 42 d递增负荷跑台训练及OPC干预对大鼠T/Cor比值的影响

血清T/Cor比值是运动人体科学领域评价运动负荷状况及诊断过度训练的金标准[12]。为评测过度训练动物模型是否成功建立及OPC的干预效果，本实验对各组大鼠血清T及Cor的水平进行了检测。表1显示:对组间血清T水平而言，OM组较C组极显著降低(P＜0.01)，OOM组较OM组极显著升高(P＜0.01)；对组间血清Cor水平而言，OM组较C组极显著升高(P＜0.01)，OOM组较OM组极显著降低(P＜0.01)；对组间血清T/Cor比值而言，其变化趋势与血清T的变化趋势相一致。从表1数据可知，OM组大鼠T/Cor比值较C组下降86.48%，达到相关过度训练诊断标准(血清T/Cor比值下降30%以上)[12]，说明本实验采用的42 d递增负荷跑台训练方案成功建立了过度训练模型。同时，OOM组T/Cor比值较OM组大幅提升，但与C组比较其下降幅度仍达到37.76%，说明OPC干预在一定程度上可缓解和改善长时程、大强度运动所致过度训练。

表1 运动及OPC干预对大鼠血清T/Cor水平的影响Table 1 Effects of exercise and OPC intervention on serum T/Cor levels of rats(±s)

表1 运动及OPC干预对大鼠血清T/Cor水平的影响Table 1 Effects of exercise and OPC intervention on serum T/Cor levels of rats(±s)

注:与C组比较，**表示具有极显著性差异(P＜0.01)；与OM组比较，##表示具有极显著性差异(P＜0.01)。Notes:**P＜0.01 vs.C group；##P＜0.01 vs.OM group.

G r o u p C O M O O M n 1 2 1 1 1 4 T/(n g·m L-1)1.7 8±0.7 3 0.4 8±0.1 3**1.2 4±0.6 5##C o r/(n g·m L-1)2 3.7 9±3.9 2 4 5.9 3±6.9 4**3 0.1 3±8.4 0##T/C o r(1 0-2)8.2 1±4.4 2 1.1 1±0.4 5**5.1 1±3.5 8##

2.2 42 d递增负荷跑台训练及OPC干预对大鼠骨骼肌SOD活性和MDA、3-NT、8-OHdG含量的影响

研究表明，SOD活性可以有效反映机体抗氧化能力[13]；MDA可以敏感地反映体内脂质过氧化水平[1]；3-NT和8-OHdG则分别是蛋白质和DNA氧化应激损伤的标志物[14]。这些指标能够直接或间接反映骨骼肌氧化损伤程度。为此，本实验选择以上指标评测6周递增负荷跑台训练致过度训练及OPC干预对大鼠骨骼肌抗氧化应激能力的影响。表2显示:在SOD活性方面，OM组较C组显著降低(P＜0.05)，OOM 组较 OM 组极显著升高(P＜0.01)；在MDA、3-NT和8-OHdG含量方面，OM组较C组极显著升高(P＜0.01)，OOM组较OM组显著或极显著降低(P＜0.05或P＜0.01)。以上数据提示:6周递增负荷跑台训练诱发大鼠过度训练的同时导致大鼠骨骼肌出现多层面氧化应激损伤；OPC干预可以有效提升大鼠骨骼肌抗氧化和清除自由基的能力，预防和延缓氧化应激损伤的发生与发展。

表2 运动及OPC干预对大鼠骨骼肌SOD活性和MDA、3-NT、8-OHdG含量的影响Table 2 Effects of exercise and OPC intervention on SOD activity and the contents of MDA，3-NT and 8-OHdG in rat skeletal muscle(±s)

表2 运动及OPC干预对大鼠骨骼肌SOD活性和MDA、3-NT、8-OHdG含量的影响Table 2 Effects of exercise and OPC intervention on SOD activity and the contents of MDA，3-NT and 8-OHdG in rat skeletal muscle(±s)

注:与C组比较，*表示具有显著性差异(P＜0.05)，**表示具有极显著性差异(P＜0.01)；与OM组比较，#表示具有显著性差异(P＜0.05)，##表示具有极显著性差异(P＜0.01)。Notes:*P＜0.05，**P＜0.01 vs.C group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs.OM group.

G r o u p C O M O O M n 1 2 1 1 1 4 S O D/(U·m g-1)5 6.5 0±3.1 1 5 3.1 5±2.9 7*6 1.8 5±4.5 9##M D A/(n m o l·m g-1)0.9 0±0.2 1 1.2 5±0.2 2**0.7 4±0.1 4#3-N T/(n m o l·L-1)4 7.7 4±2 1.3 4 8 0.1 2±2 1.0 3**5 8.6 3±2 3.9 1#8-O H d G/(n g·L-1)1 2.1 6±1 3.1 9 3 6.6 4±9.2 8**1 8.1 5±6.1 5##

2.3 42 d递增负荷跑台训练及OPC干预对大鼠骨骼肌p38 MAPK信号通路相关蛋白质表达的影响

p38 MAPK是MAPK信号系统中重要的信号通路，在保持机体内氧化/抗氧化动态平衡和运动信号转导中发挥重要作用。运动中肌肉收缩可激活p38 MAPK信号通路，且运动强度与p38 MAPK激活程度呈正相关[1]。同时，p38 MAPK的活化与过度训练致运动性骨骼肌损伤密切相关[15]。为此，本实验检测了骨骼肌p38 MAPK的蛋白质表达水平及其磷酸化水平，以评价42 d递增跑台训练对骨骼肌的损伤程度及OPC的干预效果。从表3和图2的结果可知，OM组p38 MAPK及其磷酸化水平均显著高于C组(P＜0.05)，同时OOM组显著低于OM组(P＜0.05)，说明42 d递增负荷跑台训练激活了p38 MAPK信号通路，使p38 MAPK磷酸化水平升高，同时p38 MAPK蛋白过度表达；OPC干预可以有效抑制p38 MAPK信号通路的活化并下调p38 MAPK蛋白的过度表达。

图2 各组大鼠骨骼肌p38 MAPK和p-p38 MAPK的表达情况(免疫组化分析，400×)C:安静对照组；OM:过度训练组；OOM:OPC干预组(标尺:20 μm)。采用免疫组织化学(石蜡切片)法检测p38 MAPK和pp38 MAPK的蛋白质表达水平。蛋白质表达分析以切片阳性细胞数和染色强度为依据。显微镜下视野细胞核阳性由强至弱依次为深棕色、棕黄色、浅黄色，蓝色为阴性。Fig.2 Expressions of p38 MAPK and p-p38 MAPK in rat skeletal muscle in each group(IHC，400×)C:Control group；OM:Overtraining group；OOM:OPC treatment combined with overtraining group(scale bar:20 μm).Immunohistochemistry analysis(paraffin section)was employed to test the expressions of p38 MAPK and p-p38 MAPK.Analysis of protein expression was based on the number of positive cells and staining intensity in the sections.Under the microscope，the positive nuclei of skeletal muscle cells(from strong to weak)were dark brown，brownish yellow and light yellow，respectively，and the negative ones were stained blue.

表3 运动及OPC干预对大鼠骨骼肌p38 MAPK/p-p38 MAPK表达的影响Table 3 Effects of exercise and OPC intervention on p38 MAPK/p-p38 MAPK expressions in rat skeletal muscle(±s)

表3 运动及OPC干预对大鼠骨骼肌p38 MAPK/p-p38 MAPK表达的影响Table 3 Effects of exercise and OPC intervention on p38 MAPK/p-p38 MAPK expressions in rat skeletal muscle(±s)

注:与C组比较，*表示具有显著性差异(P＜0.05)；与OM组比较，#表示具有显著性差异(P＜0.05)。表4注释相同。Notes:*P＜0.05 vs.C group；#P＜0.05 vs.OM group.These are same in the Table 4.

G r o u p C O M O O M n 1 2 1 1 1 4 p 3 8 M A P K 1 5 5.0 9±2 5.4 8 2 4 0.6 1±3 3.6 2*1 8 0.5 0±2 6.5 0#p-p 3 8 M A P K 1 0 8.3 7±1 9.7 0 1 5 8.9 4±2 7.5 8*8 6.9 4±2 5.6 4#

2.4 42 d递增负荷跑台训练及OPC干预对大鼠骨骼肌组织形态的影响

病理诊断是骨骼肌损伤诊断的金标准[2]。图3显示:400倍光镜下，C组大鼠骨骼肌形态正常，细胞核未见肿胀、固缩现象；OM组骨骼肌肌纤维间细胞增生，大量炎性细胞浸润，血管周围胶原增生严重；OOM组大鼠骨骼肌损伤程度较OM组明显改善，仅出现轻度炎性细胞浸润。上述结果说明，6周递增负荷跑台训练诱发过度训练的同时引发大鼠骨骼肌组织形态出现病理性改变；OPC干预可以在一定程度上对运动损伤起到预防和缓解的作用。

图3 各组大鼠骨骼肌的组织形态学变化(HE染色，400×)C:安静对照组；OM:过度训练组；OOM:OPC干预组(标尺:20 μm)。红色箭头:血管周围胶原增生；黄色箭头:炎性细胞浸润。Fig.3 Pathological changes in skeletal muscle in each group of rats(HE，400×)C:Control group；OM:Overtraining group；OOM:OPC treatment combined with overtraining group(scale bar:20 μm).Red arrow:Perivascular collagen hyperplasia；Yellow arrow:Inflammatory cell infiltration.

2.5 42 d递增负荷跑台训练及OPC干预对大鼠血清CK、LDH活性的影响

体育实践中，人们常以机体运动后血液循环系统中CK、LDH等骨骼肌细胞渗出物浓度来评价骨骼肌损伤程度及机体对运动负荷适应与疲劳恢复程度[16]。为此，本实验选用二者评价42 d递增负荷跑台训练致过度训练及OPC干预对骨骼肌损伤程度的影响。表4显示:在CK活性方面，OM组较C组显著上升(P＜0.05)，OOM组较OM组显著下降(P＜0.05)；在LDH活性方面，OM组较C组显著上升(P＜0.05)，OOM组较OM组呈现下降趋势，但无显著性差异(P＞0.05)。这说明6周递增负荷跑台训练诱发过度训练的同时导致大鼠骨骼肌损伤；训练期间的OPC干预可以有效改善和缓解骨骼肌损伤。

表4 运动及OPC干预对大鼠血清CK和LDH酶活的影响Table 4 Effects of exercise and OPC intervention on serum CK and LDH activities of rats(±s)

表4 运动及OPC干预对大鼠血清CK和LDH酶活的影响Table 4 Effects of exercise and OPC intervention on serum CK and LDH activities of rats(±s)

G r o u p C O M O O M n 1 2 1 1 1 4 C K/(U·L-1)5 3 4.3 5±2 7 0.0 4 9 5 0.5 9±8 5.1 1*7 5 9.2 3±1 2 3.6 3#L D H/(U·L-1)1 0 7 3.6 1±2 1 8.2 1 1 7 8 3.3 5±4 2 6.3 2*1 5 0 4.7 2±4 1 3.2 4

3 讨论

骨骼肌是机体最直接参与运动的器官，同时也是运动时主要供能和最大的耗能/耗氧器官[17]。研究表明，氧化应激是长时程、大强度运动所致骨骼肌损伤的主要发病因素[1～4]。MAPKs是运动中氧化应激主要的信号转导通路，p38 MAPK的活化参与了运动应激特别是氧化应激致骨骼肌损伤的发生与发展[6]，运动强度及p38 MAPK活化程度与过度训练致运动性骨骼肌损伤密切相关[1，6，15]。OPC通过清除体内过量堆积的自由基，提高抗氧化酶活性，可以有效地拮抗大强度运动诱导的氧化应激[8]，从而保护骨骼肌结构/功能，但具体作用机制尚不明确。

本实验采用42 d递增负荷跑台训练建立长时程、大强度运动致运动性骨骼肌损伤动物模型。实验结果显示，与C组比较，OM组血清T/Cor比值大幅下降，达到相关过度训练诊断标准；骨骼肌组织形态发生病理性改变；血清中CK、LDH等骨骼肌损伤标志物的活性发生显著性变化(P＜0.05)，说明建模成功。此外，OOM组血清T/Cor比值虽然未恢复到C组的水平，但是较OM组大幅度提升，同时OOM组大鼠骨骼肌组织形态、血清CK活性较OM组显著改善，说明训练期间的OPC干预在一定程度上可改善和缓解长时程、大强度运动所致过度训练及骨骼肌结构/功能损伤。

研究表明，骨骼肌中SOD活性及MDA、3-NT和8-OHdG含量能够从不同层面直接或间接反映骨骼肌氧化损伤程度[1，13～14]。p38 MAPK 信号通路与运动及其引发和加剧的氧化应激密切相关，而过度训练引发的自由基过量堆积和机体抗氧化能力的下降是p38 MAPK活化和活性增加的重要机制[1，15]。本实验中，与C组比较，OM组SOD活性显著降低(P＜0.05)，MDA、3-NT 和 8-OHdG 含量极显著升高(P＜0.01)，p38 MAPK及其磷酸化水平显著提高(P＜0.05)，说明过度训练加剧了氧化应激反应，使自由基过量生成，进而激活p38 MAPK信号通路。在Cho等[18]的研究中，可可原花青素通过阻止PC12细胞中p38 MAPK的活化，抑制过氧化氢诱导的细胞凋亡。Jia等[19]的研究发现，葡萄籽原花青素提取物有助于减轻HLE-B3细胞中过氧化氢引起的氧化应激，并可抑制MAPK信号通路的激活。Kim等[20]的研究认为，葡萄籽原花青素提取物可以抑制人类肺泡Ⅱ型上皮细胞(A549)中经由白介素-17介导的白介素-6的表达增多，这一过程是通过抑制p38 MAPK的磷酸化来实现的。本研究结果显示，与OM组比较，OOM组SOD活性极显著升高(P＜0.01)，MDA、3-NT 和 8-OHdG含量显著或极显著降低(P＜0.05或P＜0.01)，p38 MAPK蛋白及其磷酸化水平显著降低(P＜0.05)。综合以上信息可知，OPC干预可能通过有效地提高大鼠骨骼肌中抗氧化酶活性，提升机体抗氧化能力，从而清除长时程、大强度运动过程中过量产生的自由基，延缓或抑制氧化应激加剧，缓解其对骨骼肌造成的脂质过氧化反应及p38 MAPK信号通路蛋白质的过度活化和表达，最终多层面缓解过度训练大鼠骨骼肌的结构/功能损伤。

4 结论

在本实验条件下，OPC可以通过改善氧化应激，下调p38 MAPK/p-p38 MAPK的表达，保护过度训练大鼠骨骼肌结构/功能。其具体机制可能是通过多层面、多靶点提升骨骼肌抗氧化能力，缓解长时程、大强度运动过程中过量自由基的产生和堆积，进而延缓或抑制氧化应激的加剧及p38 MAPK信号通路蛋白质的过度活化和表达。