含氧敷料对巴马小型猪皮肤全层创伤愈合效果研究

王颖秋，郑 岩，王春伟，高漫雪，王相国通信作者

(1.北京农学院动物科学技术学院，北京 102206；2.北京朗心睿明生物技术有限公司，北京 102299；3.新疆生产建设兵团第七师畜牧兽医站，新疆 伊犁 833200)

0 引言

皮肤是机体的第一道防线，能够防止外界有害物质对机体的入侵以及阻止体内各种营养物质的流失，起到维持机体内环境稳态的屏障作用[1]。而皮肤受伤后，一般情况下，伤口暴露在外会引起细菌感染、水分和蛋白质流失、内分泌功能失调和免疫系统破坏、严重时还会引起一系列临床并发症。这种情况下，在伤口处覆盖伤口敷料使伤口处于一个利于愈合的微环境对于伤口的愈合和后期的临床治疗至关重要[2-3]。

理想的伤口敷料除了具有保持伤口环境的最佳湿度外，还具备避免伤口发生二次感染、可吸收伤口渗出液、减少伤口表面坏死、保持创面弹性、生物相容性良好等功能[4]。目前，在“湿性愈合理论”的支撑下，创面的治疗发生了革命性的变化。临床治疗中，泡沫敷料、高压敷料、负压敷料、胶原敷料、海藻酸钠敷料等主动型敷料(新型伤口敷料)已经逐渐取代了被动型敷料(如干纱布和油纱布等)[5-12]。

影响伤口愈合的因素有很多，而氧气则是影响伤口愈合过程中一种至关重要的因素，因此从氧气这一因素着手来探究含氧敷料对皮肤全层创伤的愈合效果。含氧敷料除了能为伤口提供必要的氧气之外，还有抑菌、保持创面湿润、隔热等促进伤口愈合的作用。目前，含氧敷料在国外已经被普遍应用，但在国内应用或者报道还较少。而小型猪的皮肤结构与人类的皮肤结构极为相似，且小型猪全层皮肤缺损创面模型制备简便、快速，创伤程度均一，是进行创伤愈合及外用药物对创面愈合影响研究的较理想模型。用此模型可进行创面面积、伤腔容积、愈合时间及创面组织的病理、生化及分子生物学分析[14]。因此试验选用巴马小型猪来制备动物模型并用含氧敷料来研究其对于皮肤全层创口的愈合效果，确定含氧敷料促进伤愈合的有效性，进而为在国内应用到人皮肤外科治疗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验试剂、仪器与动物来源

1.1.1 主要试剂与仪器

阿托品、盐酸赛拉嗪注射液、异氟烷、含氧敷料(北京朗心睿明生物科技有限公司提供)、甲醛、特制致伤器、取材器、光学显微镜。

1.1.2 实验动物

巴马小型猪20 kg，9月龄(购自北京通和立泰生物科技有限公司)。饲喂北京科澳协力有限公司生产的标准化小型猪饲料，每头每天分2次供给其体重3%的饲料，自由饮水。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型制备与分组

巴马小型猪3头术前禁食12 h，4 h禁水，然后称重，用0.05 mg/kg阿托品和0.1 mL/kg盐酸赛拉嗪注射液进行肌肉注射，待小型猪肢体活动稳定后，取俯卧位固定于手术台上。将呼吸面罩与麻醉呼吸机连接，吸入5%浓度的异氟烷进行麻醉诱导，当小型猪的四肢出现松弛、活动消失后，及时进行气管内插管术，使用浓度为0.5%异氟烷进行麻醉维持[15]。①伤口规划：在小型猪背部剃毛，面积为40 cm×25 cm，消毒完毕后以背部脊柱为正中线，在两侧各2 cm处由前至后各规划4个边长为5 cm的正方形创面，总共8个创面(图1A)。②取皮操作：用特制致伤器(直径18 mm打孔器)在规划好的区域进行取皮操作，垂直于皮肤向下钻至肌肉筋膜，抽出致伤器，剪去已钻掉的皮肤[14]，形成8个深达肌肉筋膜的正方形全层皮肤缺损创面(图1B)。③伤口包扎：将正中线左右两侧所制备的创面分别为空白对照组和实验组，空白对照组的创面用普通纱布进行包扎，实验组的创面则用含氧敷料进行包扎(图1C)。在术后0 d、7 d、14 d、21 d分别拍照，观察创口恢复情况。

图1 小型猪同体自身对照全层皮肤缺损创面(左侧为普通纱布包扎，右侧为含氧敷料包扎)

1.2.2 取样与HE染色

在术后0 d、7 d、14 d、21 d时用直径为1 mm的取材器在每个创面均匀取5个深至肌层的、直径为1 mm的柱状组织块，然后用10%甲醛溶液固定组织块，常规石蜡包埋、切片，进行苏木精-伊红(HE)染色[15]，显微镜观察组织切片并拍照。

1.2.3 CD31 免疫组化染色

分别取普通绷带和含氧敷料处理7 d、14 d、21 d猪全层皮肤，石蜡包埋并切片，石蜡切片脱蜡至水；3%H2O2室温孵育5～10 min，以消除内源性过氧化物酶的活性；蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min，(如需采用抗原修复，可在此步后进行)； 5%～10%正常胎牛血清(PBS稀释)封闭，室温孵育10 min。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1～2 h；PBS冲洗，5 min×3次；滴加适当比例稀释的生物素标记二抗(1%BSA-PBS稀释)，37℃孵育10～30 min；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10～30 min；PBS冲洗，5 min×3次；滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素(PBS稀释)，37℃孵育10～30 min；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10～30 min；PBS冲洗，5 min×3次；显色剂显色(DAB或AEC)；自来水充分冲洗，复染，封片，照相。

1.2.4 Masson染色分析

石蜡切片脱蜡至水；铬化处理或去汞盐沉淀(甲醛固定的组织此步可略)；依次自来水和蒸馏水洗；用Regaud苏木精染液或Weigert苏木精液染核5～10 min；充分水洗，如过染可盐酸酒精分化；蒸馏水洗；用Masson丽春红酸性复红液5～10 min；以2%冰醋酸水溶液浸洗片刻；1%磷钼酸水溶液分化3～5 min；不经水洗，直接用苯胺蓝或光绿液染5 min；以0.2%冰醋酸水溶液浸洗片刻；95%酒精、无水酒精、二甲苯透明、中性树胶封固，照相。

1.2.5 数据分析

所有图片均为3次独立重复试验后选取的代表性图片。

2 结果

2.1 大体观察结果

术后7 d时，普通纱布处理和含氧敷料处理的所有创面均已结痂，普通纱布绷带组(对照组)的创面形成干痂，颜色较深，触之坚硬且比较干燥，含氧敷料组(实验组)的创面结痂颜色较浅，触之较为柔软湿润。术后14 d时，部分痂皮已脱落，对照组痂皮脱落后的部分可见瘢痕组织生长不平整，实验组痂脱落后部分瘢痕组织较为平整。术后21 d时2组处理创面的痂皮已基本脱落，对照组创面瘢痕触之干燥，质地较硬且不平整，而实验组的创面瘢痕触之柔软有弹性且较为平整，如图2所示。

图2 术后不同时间点各组小型猪全层皮肤缺损创面大体观察(左侧为普通纱布包扎，右侧为含氧敷料包扎)

2.2 组织学观察结果

HE染色结果显示，治疗7 d时，对照组和实验组真皮细胞层内均可见大量炎性细胞浸润，表皮层形成不良；实验组表皮基底层已形成一层完整的单层基底细胞，而对照组基底层细胞尚不完整。实验组表皮棘层细胞核染数量明显多于对照组。治疗14 d时，实验组表皮层细胞层数明显多于对照组。治疗21 d时，对照组和实验组表皮各层细胞均已完成修复，而实验组真皮乳头修复明显好于对照组，如图3所示。

图3 术后不同时间点各组小型猪全层皮肤缺损创面苏木精-伊红染色结果观察( 200 μm)

2.3 CD31检测结果

CD31指代血管内皮细胞形成，免疫组化结果显示，治疗7 d和14 d时，实验组中CD31蛋白的表达强度明显强于对照组中CD31蛋白的表达强度。而在治疗21 d时，对照组中CD31蛋白的表达强度明显强于实验组中CD31蛋白的表达强度。说明含氧敷料在治疗的早期就已经促进了血管内皮细胞的形成，加速损伤局部血管形成，加速愈合，如图4所示。

图4 术后不同时间点各组小型猪全层皮肤缺损创面CD31蛋白表达结果观察

2.4 Masson检测结果

Masson染色中胶原纤维、黏液、软骨呈蓝色，胞浆、肌肉、纤维素、神经胶质呈红色，胞核黑蓝色。在治疗的7 d和14 d，实验组中蓝色胶原纤维的增殖明显强于对照组，且在14 d时排列紧密，并交织成网，促进了真皮层的修复。治疗21 d时，对照组中胶原纤维才出现增殖，而实验组中皮下脂肪已经形成，如图5所示。

3 讨论

皮肤创面愈合是炎性细胞、修复细胞、细胞因子、细胞外基质等多种因素共同参与，并相互调控又高度协调的复杂过程[16]。而氧气对上述各种因素的合成有重大影响，含氧敷料正是利用这点，对创面输送氧气来促进创口的愈合，起到减少感染，保持创面湿润等作用。

本研究中所用的含氧敷料可以向伤口部位提供氧气，促进伤口愈合，同时可以解决胶原类敷料因为吸水而易破损，薄膜类敷料不透水造成的频繁更换，海藻酸钠类敷料与水反应生成明胶和皮肤粘连不易分离等问题[1]。空白对照组使用的是以纱布为代表的传统敷料，现在在临床上使用广泛，但其缺点是容易与创面粘连，抗感染能力差，主要原敷料吸收大量渗出物并干燥，更换时敷料粘连引起病人疼痛、新生上皮脱落等情况[5]。

图5 术后不同时间点各组小型猪全层皮肤缺损创面masson染色结果观察

通过直观伤口发现，含氧敷料包扎创面结痂颜色较浅，保持湿润状态，触之柔软，创面愈合较快；普通纱布包扎创面结痂颜色深，坚硬干燥，创面愈合较慢。含氧敷料还有保持创面湿润的作用，但也不会使创面过度湿润导致愈合组织耐力降低，从而提高了伤口的愈合速度。众多研究同样证实“湿性愈合”有利于创面愈合，湿润的环境促进组织纤维蛋白溶解及毛细血管形成，调节伤口氧张力，促进多种生长因子释放并上调其活性，从而加速愈合速度[5]。

组织学结果证实，在术后7 d时，实验组的创面已有大量血管内皮细胞增生，用于新生毛细血管的合成，为创口愈合营造良好的组织生长环境，14 d后实验组创面的毛细血管数量要多于对照组。良好的局部血液循环能保证伤口修复所需要的营养和氧，有利于坏死物质吸收、运输，控制局部感染。研究发现伤口胶原蛋白含量、伤口创面强度与组织氧张力和组织灌注呈正相关[17]。若创面组织处于持续缺氧状态，则会导致创口炎症症状维持甚至严重，从而阻障创口愈合的进程。此外，用含氧敷料包扎伤口还能够维持创面组织氧分压，以维持白细胞活性，起到抑菌的作用，并且促进胶原蛋白合成和细胞再生。然而，术后21 d时对照组创面的成纤维细胞数量要远多于实验组，成纤维细胞的过量增殖虽然有利于胶原蛋白的合成，但是促进肉芽组织的过度生长，导致伤口的疤痕形成。而含氧敷料能够保证适度肉芽组织的增殖，减少疤痕组织的形成。

根据CD31和Masson检测结果可知，整个愈合过程中实验组CD31的表达强度要明显强于对照组，并且实验组中胶原纤维的增值速度也明显快于对照组。在术后14 d时，实验组创面的胶原纤维已是排列紧密的状态，而对照组的还未开始增殖；术后21 d时，实验组创面的皮下脂肪已基本形成，而对照组的胶原纤维才开始增殖，且实验组的血管形成也明显快于对照组。综合以上各项实验结果可知，采用含氧敷料的实验组在创口早期就对创口愈合有明显的促进作用，包括促进细胞和胶原蛋白合成再生，促进血管内皮细胞和胶原纤维增殖等，为创口的愈合营造了一个优良的环境。

4 结论

本实验利用巴马小型猪来构建动物模型，并采用了同体自身对照的方法来研究含氧敷料对全层皮肤创伤的愈合效果。研究结果显示，含氧敷料能够为创面提供氧气，来促进成纤维细胞、血管内皮细胞等的增殖，提高各种细胞因子的活性，保持创面湿润，并且起到了抑制细菌生长繁殖，减少创口感染的作用，从而加速创伤愈合。含氧敷料对巴马小型猪皮肤全层创伤的愈合有显著促进效果。