染色体结构异常PGT周期中囊胚评估参数与其整倍体率的相关性

孙庆云，杜元杰，王跃，朱序理，周亮，曹金凤，赵志明，郝桂敏

(河北医科大学第二医院生殖医学科，石家庄 050000)

染色体结构异常包括染色体平衡易位、罗氏易位、倒位，夫妇一方或双方携带染色体结构异常时往往会发生反复的孕早期流产，给患者带来很大的困扰。胚胎植入前遗传学检测(Preimplantation genetic test，PGT)是在胚胎植入着床之前对早期胚胎进行染色体数目、结构异常以及某些单基因病的检测，挑选正常的胚胎植入子宫，以期获得正常的妊娠，提高患者的临床妊娠率，降低流产率，预防出生缺陷。对于患者而言，活检囊胚的数量和质量决定了其可移植囊胚的数量和最终的妊娠结局。有研究显示，囊胚的整倍体率和囊胚的评估参数有一定的相关性，但结论不一[1-2]。如何在降低患者花费的前提下最大限度的提高囊胚的利用率是我们面对的难题，本文对我中心因染色体结构异常行PGT检测的囊胚分别采用周期特征性分析、广义评估方程GEE模型和分类决策树模型来分析囊胚的整倍体率，以探讨囊胚评估参数与其整倍体率的相关性。

资料与方法

一、研究对象

选取2019年1月至2020年6月在河北医科大学第二医院生殖医学科因夫妇双方或一方染色体结构异常行PGT的83例患者(共97个周期)为研究对象，对其所检测囊胚的PGT数据进行回顾性分析。将所有患者按照一般情况、周期基本情况以及活检囊胚情况进行逐层分组，比较各亚组囊胚的PGT检测结果。纳入标准：(1)夫妇双方或一方染色体结构异常行PGT的周期；(2)本周期至少有1枚可活检囊胚；(3)书面签署PGT知情同意书。排除标准：(1)因单基因病行PGT的周期；(2)夫妇一方或双方染色体结构异常但未行囊胚活检的周期。

二、研究方法

1.体外受精与胚胎培养：所有患者采用我中心常规促排卵方案[3]，取卵日采用超声引导下经阴道穿刺取卵。所有周期采用卵胞浆内单精子注射(ICSI)方式授精，ICSI后置于卵裂期培养液(G-1plus，Vitrolife，瑞典)进行常规胚胎培养及观察，第3天(D3)观察胚胎情况并将可利用胚胎转移至囊胚培养液(G-2plus，Vitrolife，瑞典)继续培养至D5或D6。

2.囊胚评级：囊胚评价采用Gardner囊胚评分系统[4]，根据囊胚扩张和孵出程度将囊胚分为1～6期：1期为早期囊胚，囊胚腔体积小于囊胚的二分之一；2期囊胚的囊胚腔体积大于囊胚的二分之一；3期为完全扩张囊胚，囊胚腔占据整个囊胚；4期为扩张后囊胚，囊胚腔体积较早期囊胚明显扩大，透明带变薄；5期为正在孵化的囊胚，囊胚正在从透明带破裂口孵出；6期为孵化出的囊胚，囊胚完全从透明带中脱出。内细胞团(Inner cell mass，ICM)和滋养层细胞(Trophoblast cell，TE)评级根据细胞数目和紧凑程度评为A、B、C级：A级为细胞数目多，结合紧密；B级为细胞数目较少，结合较松散；C级为细胞数目极少。

3.囊胚活检：活检囊胚标准：囊胚发育至D5、D6或D7，扩张程度为3期及以上，囊胚ICM与TE评级不同时为C级。活检时使用激光在透明带远离ICM的位置打孔，使用30 μm内径的活检针吸取滋养层细胞5～10个，将活检的细胞转移至装有2 μl PBS的PCR管内，短暂离心后置于-20℃冻存待检。活检后囊胚采用玻璃化冷冻方法(KITAZATO Vitrofaction KIT，加藤，日本)冷冻后置于液氮罐保存。

4.PGT检测：活检细胞样本采用SurePlex DNA Amplification System试剂盒(Illumina，美国)进行全基因组扩增，扩增后进行文库构建及纯化，然后通过MISEQ平台对扩增产物进行测序，pgxcloud分析系统进行分析并比对hg19数据库出具PGT报告，检出范围：23对染色体非整倍体、4 Mb及以上的片段缺失/重复、30%及以上的嵌合，其中片段缺失/重复以及嵌合体囊胚均按非整倍体计算[5]。

5.观察指标：记录各组活检囊胚的评估参数，分析囊胚的整倍体率与女方年龄、男方年龄、女方基础FSH/LH比值、女方体重指数(BMI)、PGT指征、染色体结构异常来源男方/女方、获卵数、促排方案、Gn总量、活检囊胚数以及囊胚活检时的发育天数、囊胚扩张程度、ICM级别、TE级别的相关性。

三、统计学分析

结 果

一、活检囊胚检测结果

本次研究共纳入83例患者(97个PGT周期)。共活检371枚囊胚，其中整倍体囊胚154枚(41.51%)，非整倍体囊胚217枚(58.49%)。

二、活检囊胚整倍体率单因素分析

1.患者基本情况与整倍体率：将所有患者按照一般情况逐层分组，研究结果显示，女方18.5≤BMI<24 kg/m2组囊胚整倍体率(48.37%)显著高于BMI<18.5 kg/m2组(23.81%)和BMI≥24 kg/m2组(36.44%)(P<0.05)；而女方年龄、男方年龄、女方基础FSH/LH比值与囊胚整倍体率均无显著相关性。

表1 活检囊胚整倍体率单因素分析(%)

2.PGT指征与整倍体率：根据患者进行PGT周期的指征进行逐层分组，结果显示：染色体结构异常行PGT的周期中，平衡易位组囊胚整倍体率(31.88%)显著低于罗氏易位组(52.85%)和倒位组(56.10%)(P<0.05)；而按性别不同将染色体结构异常来源分成女方、男方两组时，两组囊胚整倍体率无显著差异(P>0.05)。

3.促排卵周期与整倍体率：根据患者周期基本情况进行逐层分组，结果显示，促排周期中Gn总量<2 250 U组囊胚整倍体率(50.00%)显著高于Gn总量2 250～3 000 U组(38.06%)和Gn总量>3 000 U组(34.15%)(P<0.05)；而促排卵方案、获卵数、每周期可活检囊胚个数与囊胚整倍体率均无显著相关性(P<0.05)。

4.活检囊胚情况与整倍体率：根据患者活检囊胚情况进行逐层分组，研究显示，D5活检囊胚的整倍体率(53.53%)显著高于D6(31.96%)和D7(14.29%)(P<0.05)；囊胚的整倍体率随活检囊胚的扩张程度升高呈现增加的趋势，但尚无统计学差异(P>0.05)；活检囊胚的ICM评级为A级的囊胚整倍体率(67.74%)均显著高于B级(39.02%)和C级(39.62%)(P<0.05)；活检囊胚的TE评级为A级的囊胚整倍体率(70.00%)高于B级(46.98%)和C级(36.32%)，差异均有统计学意义(P<0.05)。

三、囊胚整倍体率相关因素的广义评估方程GEE模型分析

纳入女方年龄、男方年龄、女方BMI、基础激素水平(FSH、LH、E2)、促排情况(Gn总量、Gn天数)、获卵数、MⅡ卵数、染色体异常类型及来源、每周期活检囊胚个数以及活检囊胚的评估参数(发育天数、扩张程度、ICM/TE评级)等可能与囊胚整倍体率相关的因素进行GEE模型分析。结果显示，活检囊胚发育天数及扩张程度与囊胚整倍体率均具有显著相关性(P<0.05)，OR值分别为4.400[95%CI(1.553，12.465)]、0.344[95%CI(0.128，0.928)]；而女方年龄、男方年龄、女方BMI、获卵数、MⅡ卵数、基础激素水平(FSH、LH、E2)、促排情况(Gn总量、Gn天数)、囊胚ICM、TE评级均与其整倍体率无显著相关性(P>0.05)(表2)。

表2 囊胚整倍体率相关因素的广义评估方程GEE模型分析

四、SPSS分类决策树模型

采用SPSS 22.0分类决策树以整倍体率增加(生长法)分析囊胚参数相关性指标。指定项：以囊胚是否为整倍体为因变量；以PGT指征、染色体结构异常来源于男方/女方、活检囊胚发育天数、期别、ICM和TE评级作为自变量，女方年龄为影响变量，使用生长法生成两个分区；在每个分区中执行相同的过程，直到没有变量向树添加值为止，结果显示共生成3组节点：第1组节点为PGT指征：倒位及罗氏易位患者的整倍体率显著高于平衡易位患者(χ2=19.164，P=0.000)(P<0.05)；第2组节点为囊胚发育天数，活检时发育天数为D5的囊胚整倍体率显著高于D6和D7囊胚(χ2=10.824，P=0.003)(P<0.05)；第3组节点为染色体结构异常来源于男方/女方：在倒位及罗氏易位患者中，男方核型异常患者其囊胚整倍体率显著高于女方核型异常患者(χ2=5.552，P=0.018)(P<0.05)，但是在平衡易位患者中，女方核型异常患者其囊胚整倍体率显著高于男方核型异常患者(χ2=5.320，P=0.021)(P<0.05)，交叉验证正确百分比64.2%(图1)。

讨 论

随着囊胚活检和二代测序技术日趋成熟，很多染色体结构异常的患者可以通过PGT技术得到整倍体的囊胚进行移植，避免了反复流产和出生畸形儿的风险，但是PGT检测费用仍然相对较高，为了更好地提高患者的囊胚利用效率和节省费用，活检囊胚的选择就显得很重要。目前，各中心通常采用Gardner囊胚评分方法，囊胚发育天数、扩张程度、ICM、TE这四者之间具有相对独立性，而各参数与囊胚整倍体率的相关性，国内外文献报道也存在争议[5-7]。

本文使用3种分析方法即周期特征性分析、分类决策树模型和广义评估方程GEE模型对数据进行统计分析。周期特征性分析是将周期各个指标作为囊胚整倍体率的独立因素，进行t检验、方差分析或χ2检验，简单易行，得出的数据比较直观，但是这种统计方法忽略了各指标之间的相互影响，忽略了本实验数据实质为重复测量数据的特性；分类决策树模型实质是从多个指标中挖掘出有意义的指标并按相关程度排序生成节点，得出的结论比较直观，易于理解和解释，可以清晰的看出哪些字段比较重要，但是在样本量较少的情况下，有可能筛选排除掉一些有意义的指标；广义评估方程GEE模型是将囊胚数据属于重复测量这一特性考虑其中，比如1名平衡易位的患者活检了6枚囊胚，而另1名罗氏易位的患者活检了2枚囊胚，这些囊胚并不是完全独立的，GEE模型在分析的时候可以将不同患者之间的基础数据进行分析并校正，这样得出的结论才更有代表性。

ICM和TE评级与其整倍体率的相关性尚未确定，由于活检操作是吸取TE，所以考虑TE与其整倍体率密切相关，但从生理学角度来看，TE和ICM并不是孤立存在的，而是作为一个有机整体共存具有相互作用的[8]。前期有些学者的研究结果也显示囊胚的扩张程度、ICM及TE评级均与其整倍体率相关，但这些指标在提示囊胚的整倍体性的过程中重要性如何报道并不一致[9-11]。本研究周期特征性分析统计结果显示，ICM和TE的不同评级其整倍体率不同，差异有统计学意义；但广义评估方程GEE模型和分类决策树模型结果则显示，ICM和TE评级与囊胚整倍体率无显著相关性，考虑可能由于ICM和TE评级这两个指标并不能完全独立。我们的活检标准是ICM和TE不能同时为C级，所以有一项指标为C级时另一个指标必须为A或B级，这样两项评级就会相互影响；再者ICM和TE评级主观性较强，这也可能会影响最终的分析结果，即便如此，从结果中我们也可以看到ICM和TE为A级的囊胚整倍体率是高于B、C级的。

相对于ICM和TE评级来说，对囊胚的发育天数和扩张程度的评估是比较客观的。囊胚发育速度被认为是评估囊胚质量的重要指标，发育速度不同的囊胚整倍体率是否存在差异仍然存在争议，Munné等[12]的研究认为，不同中心由于促排卵方案以及培养体系的不同其囊胚的整倍体率也有所不同，但与培养天数无关。Kaing等[13]研究发现，D5活检的囊胚其整倍体率显著高于D6活检的囊胚，而且Irani等[14]进行回顾性分析结果显示，移植D5囊胚的着床率及活产率均显著高于D6囊胚。本研究3种分析方法结果都发现，发育天数D5囊胚的整倍体率显著高于D6、D7囊胚，囊胚发育天数与其整倍体率具有显著相关性；本研究只有GEE模型结果显示囊胚扩张程度与其整倍体率密切相关，5～6期囊胚整倍体率高于4期和3期囊胚，这与既往一致[15]。因为囊胚发育天数与扩张程度共同体现了囊胚的发育速度，由此我们得出发育速度较快的囊胚整倍体率相对较高。

囊胚的整倍体率与患者染色体的异常类型密切相关，染色体平衡易位患者其囊胚整倍体率显著低于罗氏易位患者[16]，这与不同的结构异常其配子形成机制不同有关。比如染色体平衡易位患者在形成配子过程中共可产生18种类型的配子，其中1种完全正常，1种为携带，其余16种均为异常；而罗氏易位患者可产生6种类型的配子，其中1种完全正常，1种为携带，其余4种均为异常。有文献报道，相互易位携带者的异常胚胎比例约为68%，罗氏易位携带者异常胚胎比例约为48%[17]，这是由于易位患者其每种配子产生的几率并不完全一致，而且由于我们培养囊胚的过程中胚胎也经过了优胜劣汰，所以胚胎的整倍体率比理论上高的多。我们的周期特征性分析和分类决策树模型都显示染色体平衡易位患者囊胚的整倍体率显著低于染色体罗氏易位患者和倒位患者。另一方面，男方或女方核型异常行PGT时，其囊胚整倍体率有无差别，文献报道不一。Zhang等[18]的研究认为，男性和女性相互易位携带者其减数分裂时四价体不同分离模式的发生率是不一致的，男性携带者邻近-1模式分离显著高于女性携带者，而女性携带者邻近-2和3∶1模式分离显著高于男性。Idowu等[19]报道，相互易位和罗氏易位患者行PGT检测的结果显示，女性携带者其囊胚发生易位相关的非整倍体率显著高于男性携带者，但总体的囊胚非整倍体率在男性和女性携带者之间无显著差异。国内学者关于易位携带者性别与囊胚整倍体率的相关性也不一致。肖卓妮等[20]研究结果显示，相互易位男性携带者其囊胚整倍体率显著高于女性携带者；而刘静文等[21]则报道，染色体结构异常患者的性别与囊胚整倍体率无显著相关性。我们的研究中只有分类决策树模型显示囊胚整倍体率与染色体结构异常患者的性别具有相关性。在罗氏易位和倒位患者中，男性核型异常的患者囊胚整倍体率较高，而在平衡易位患者中，女方核型异常的患者囊胚整倍体率较高。这与之前的报道并不一致，考虑可能由于罗氏易位、倒位与相互易位减数分裂的分离模式不同，不同分离模式的发生概率也不同，进而导致最终囊胚整倍体率在男性和女性携带者之间产生了差别，这还需要进一步扩大样本量进行验证。

我们的3种分析方法结果都显示，女方年龄、男方年龄、女方基础FSH、促排卵方案以及获卵数和活检囊胚数与其囊胚整倍体率均无显著相关性。Marca等[22]报道，在行胚胎植入前非整倍体筛查的患者中，女方年龄增大其囊胚整倍体率下降；孙宝刚等[23]报道，在对D3废弃胚胎进行整倍体检测时，发现男方年龄≥40岁时其胚胎整倍体率下降显著。但这两篇报道都是夫妇染色体正常行植入前非整倍体筛查的研究与我们所分析的染色体结构异常患者有所不同。我们的数据显示，女方和男方年龄≥35岁时，囊胚整倍体率有下降趋势，由于我中心染色体结构异常患者多因为反复流产检查而得知，这部分患者年龄普遍偏低，高龄的患者例数较少，所以差异不显著，如需分析在结构异常患者中年龄是否为相关因素还需加大样本量进一步研究。我们的周期特征性分析结果还提示，女方BMI和促排的Gn总量与其囊胚整倍体率相关，BMI偏高或偏低都会使其囊胚整倍体率降低，使用Gn总量较少的患者其囊胚整倍体率较高，但分类决策树模型与广义评估方程GEE模型结果显示女方BMI和促排的Gn总量与其囊胚整倍体率没有显著相关性，所以考虑这两个指标为混杂因素，在校正之后结果显示并不是影响囊胚整倍体率的相关因素。张晋宁等[24]也报道，Gn的累积使用量以及促排卵方案与其囊胚的整倍体率没有显著相关性。

综上所述，PGT周期进行囊胚活检时，建议优先考虑囊胚的发育天数。D5活检囊胚的整倍体率最高，而D7囊胚的整倍体率仅约14%。也有报道虽然D7囊胚整倍体率较低但其种植率与D5、D6相差不大[25]，认为不应轻易放弃，这时候我们就要综合患者的经济情况决定是否进行D7囊胚的非整倍体检测；其次应考虑囊胚的扩张程度，这也是囊胚发育速度的一个重要指标；ICM和TE等级也是我们应该考虑的因素，这两个指标直接关系到冷冻解冻的复苏率和复苏后囊胚移植的妊娠率。因此，我们应建立适当的活检囊胚标准，提高患者囊胚利用率，提高患者的经济效益，缩短获得妊娠的时间。