外泌体在乳腺癌发生发展中的作用

于金正，赵润泽，魏宇辰，柳佳欣，李晓菊，张 存*

（1.第四军医大学药学系生物制药学教研室，陕西西安 710032；2.第四军医大学基础医学院学员三大队十二队；3. 第四军医大学基础医学院学员二大队八队；4.肿瘤生物学国家重点实验室）

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，严重威胁着女性的健康和生命。根据世界卫生组织国际癌症研究机构发布的2020年全球最新癌症负担数据显示，全球乳腺癌新发病例数正快速增长，并已取代肺癌成为全球第一大癌症[1]。乳腺癌的发生和发展是由多种因素共同参与的病理性过程，包括癌基因的异常激活、抑癌基因功能的丧失、信号通路的异常激活或失活等。除了乳腺癌细胞本身的生物学活动改变外，癌细胞和机体其他细胞之间的信息交流和物质交换也是参与调节乳腺癌发生发展的重要因素[2]。

外泌体是由活细胞分泌到细胞外环境的直径为30～150 nm的细胞外囊泡，主要来源于细胞内溶酶体颗粒内陷形成的多囊泡结构，是细胞外膜与多囊泡膜融合后释放到细胞外基质中的小囊泡结构。研究表明，机体内几乎所有细胞均可在生理和病理条件下分泌外泌体，参与细胞间通讯和物质交换[3,4]。外泌体可以将供体细胞的核酸物质、蛋白质、脂质等携带并传递给受体细胞，调节受体细胞的生物学功能[5]。作为最常见的实体瘤之一，乳腺癌微环境中包含着多种细胞，而乳腺癌细胞与微环境中其他基质细胞，乃至肿瘤外其他器官和组织的信息交换，均影响着乳腺癌的发展进程，在这个过程中，外泌体发挥着重要的信息传递和调节作用。一方面，乳腺癌细胞可以分泌外泌体影响微环境中的基质细胞，将这些基质细胞“驯化”成为更加有利于乳腺癌生存的亚型，帮助癌细胞生长、存活和迁移；另一方面，微环境中的其他细胞也可以以外泌体的形式向乳腺癌细胞传递影响癌细胞生存的物质信号，调节乳腺癌的发生发展[6]。外泌体与肿瘤的生长、肿瘤微环境的形成、侵袭转移、血管生成、抗肿瘤免疫应答等过程密切相关，是乳腺癌早期诊断、疗效评估和临床治疗的潜在靶点[7]。本文对外泌体在乳腺癌发生发展中的具体作用进行综述，以期能够更好、更全面地了解外泌体在乳腺癌发展进程中扮演的角色，为乳腺癌的临床诊断和治疗提供新思路和新靶点。

1 外泌体与乳腺癌发生发展

1.1 外泌体调节乳腺癌发生和生长

恶性增殖是肿瘤发生和恶性进展必不可少的环节，也是肿瘤细胞最大的生物学特征之一。大量研究显示，外泌体在调控乳腺癌细胞恶性增殖方面发挥着重要作用。一方面，外泌体可以促进乳腺癌细胞的发生。Dutta等[8]发现来自乳腺癌细胞的外泌体可以促进正常乳腺上皮细胞的癌变过程，进一步的研究显示，来自乳腺癌细胞的外泌体可以诱导人乳腺上皮细胞（human mammary epithelial cells，HMECs）产生活性氧，进而影响p53稳定性，促进DNA损伤，诱导正常乳腺上皮细胞的恶性转变。另一方面，肿瘤微环境中的外泌体也可以介导细胞间的物质信息传递，促进乳腺癌细胞的增殖和生长。乳腺癌细胞可通过外泌体携带的miR-105激活微环境中成纤维细胞的myc信号通路，改变成纤维细胞中的代谢状态，为肿瘤细胞提供更多的营养物质，促进肿瘤生长[9]。分泌型细胞生长因子是促进细胞增殖的重要成分，研究显示，肿瘤微环境中的基质细胞，尤其是肿瘤相关成纤维细胞，可以分泌携带大量生长因子的外泌体，这些外泌体被肿瘤细胞摄取后，进一步激活乳腺癌细胞的增殖信号通路，促进肿瘤细胞的增殖和存活，诱导乳腺癌的发生发展[10]。作为乳腺组织的特殊组分，脂肪细胞在肿瘤微环境中含量巨大，并且与乳腺癌细胞密切接触。近年来的研究显示，脂肪细胞来源外泌体可以被乳腺癌细胞吸收，并通过激活Hippo信号通路促进乳腺癌细胞增殖[11]。

1.2 外泌体调节乳腺癌侵袭转移

侵袭转移是乳腺癌恶性转化的标志之一，也是导致乳腺癌患者死亡的罪魁祸首。肿瘤细胞向远端器官的转移可以分为3个步骤，分别是肿瘤细胞在原位的侵袭迁移、肿瘤细胞在循环系统中的扩散以及在远端器官的定植生长。研究表明，外泌体在乳腺癌转移的各个过程中均发挥着一定的调节作用。在乳腺癌原发灶中，肿瘤相关成纤维细胞（cancer associated fibroblast，CAF）可分泌CD81阳性的外泌体，这类外泌体携带丰富的Wnt1传递给乳腺癌细胞，进而通过Wnt信号通路促进乳腺癌细胞的极性和运动能力，增强乳腺癌细胞的侵袭迁移能力[12]。在乳腺癌微环境中，肿瘤细胞高表达Survivin，该分子可以以外泌体为载体被分泌到细胞外，并被成纤维细胞摄取，诱导成纤维细胞向肿瘤相关成纤维细胞的转化，被驯化的成纤维细胞反过来诱导乳腺癌细胞的上皮间充质转化过程，进而调节乳腺癌的转移[13]。除了参与调节乳腺癌细胞在原发灶的侵袭迁移外，外泌体也影响着肿瘤细胞在血管或淋巴管道中的扩散和转移。研究显示，乳腺癌细胞可通过外泌体携带的miR-105抑制血管内皮细胞中ZO-1的表达，导致内皮细胞间连接减弱，帮助癌细胞轻松从血管外渗，并在远端器官定居增殖，形成新的转移灶[14]。另外，很多文献指出，来自肿瘤原发灶的外泌体可通过释放蛋白质或核酸类物质，诱导远端器官转移前微环境的形成，为肿瘤转移创造有利条件。Wang[15]发现乳腺癌细胞可以通过外泌体miR-122改变转移前微环境中基质细胞内的葡萄糖代谢方式，营造一个更加有利于癌细胞在远端器官的定植和生长的环境，促进疾病的进展。

1.3 外泌体调节乳腺癌血管生成

血管生成是乳腺癌这类实体瘤发生发展的重要过程，丰富的血管密度不仅为肿瘤的生长提供充足的氧气和营养物质，而且为肿瘤细胞的侵袭转移提供了更多的机会。缺氧诱导因子1α（hypoxia induced factor 1 α，HIF-1α）是细胞感知微环境中氧气浓度的关键分子，可以通过促进血管内皮生长因子等促进血管生成。近年来的研究发现，HIF-1α也可以大大促进细胞外泌体的分泌和释放，并进一步调节肿瘤内部的血管生成过程[16]。研究显示，来自肿瘤细胞的外泌体miR-210可以传递给内皮细胞，通过调节相应靶分子的表达来促进乳腺癌血管生成[17]；肿瘤细胞内SFRP1表达降低导致miR-27a高表达，这些高表达的miR-27a经由外泌体传递给内皮细胞，进而抑制内皮细胞中SFRP1的表达，加速肿瘤血管生成[18]。

1.4 外泌体调节抗肿瘤免疫应答

逃避免疫系统的监视和杀伤，即肿瘤免疫逃逸，是癌细胞得以在体内存活和生长的前提条件。肿瘤细胞可以通过多种途径调节体内的抗肿瘤反应，形成有利于其生长的免疫抑制微环境，促进肿瘤的发生发展。大量研究显示，外泌体在诱导免疫抑制微环境中发挥着重要作用。肿瘤细胞可分泌携带HSP72的外泌体激活髓系来源抑制细胞的STAT3信号通路，这些被激活的髓系来源抑制细胞通过分泌细胞因子等方式，抑制肿瘤微环境中的抗肿瘤免疫，促进肿瘤细胞的免疫逃逸[19]。乳腺癌外泌体来源gp130可以被巨噬细胞吸收，进而通过STAT3信号通路诱导巨噬细胞向M2亚型转化，并将其“驯化”为免疫抑制型巨噬细胞，以支持乳腺癌细胞的存活和生长[20]。有趣的是，近两年的文献还指出，“聪明的”肿瘤细胞可以释放含有PD-L1的外泌体，这些外泌体从肿瘤组织传播到身体的各个部位，并与活化的T细胞表面PD-1结合，诱导T细胞失能，在远端转移处形成免疫抑制的微环境，为肿瘤细胞的进一步定植和生长提供有利条件[21]。除了乳腺癌可以分泌外泌体影响微环境中的免疫细胞外，免疫细胞也可以分泌外泌体与其他细胞进行信息交互，进一步形成免疫抑制微环境，比如微环境中的调节性T细胞，可以通过外泌体释放多种microRNA，通过促凋亡或抑制增殖等方式限制辅助性T细胞和杀伤性T细胞的抗肿瘤免疫反应。此外，乳腺癌细胞产生的循环外泌体通过核因子κB信号激活巨噬细胞，并通过产生不同的炎症细胞因子诱导炎性微环境的产生[22]。总的来说，外泌体可以作为信息物质交互的介质参与微环境中免疫细胞之间的相互作用，帮助肿瘤细胞形成免疫抑制微环境，促进乳腺癌的发生发展。

2 外泌体与乳腺癌诊断治疗

2.1 外泌体介导乳腺癌治疗耐药

乳腺癌的主要治疗包括化疗、放疗、内分泌治疗和靶向治疗。然而，大部分患者在治疗过程中会出现复发耐药，给乳腺癌的临床治疗带来了巨大挑战，因此，研究耐药的潜在机制并设计有效的逆转耐药方法对乳腺癌的治疗至关重要。由于外泌体是参与细胞间通讯的关键物质，所以，外泌体能够参与乳腺癌治疗耐药也就不足为奇了。研究显示，乳腺癌细胞可以通过外泌体的形式将阿霉素和顺铂等化疗药物外排出去，从而抵抗化疗药物的杀伤。此外，耐药的乳腺癌细胞还可以通过外泌体诱导化疗敏感的细胞对药物产生抵抗。耐药乳腺癌细胞可以释放携带miRNA-30a、miRNA-100和 miRNA-222的外泌体，这些外泌体可以被附近的药物敏感性细胞摄取，并通过PTEN、APC4、p21等途径诱导受体细胞的化疗耐药[23]。化疗可以激活乳腺癌细胞内的EZH2/STAT3信号通路，诱导乳腺癌细胞分泌携带miR-378a-3p和miR-378d的外泌体，这些外泌体可以被邻近的乳腺癌细胞吸收，通过靶向DKK3和NUMB活化Wnt/NOTCH干细胞信号通路，促进细胞对化疗药物的耐受[24]。除了影响乳腺癌细胞对化疗药物的反应外，外泌体也在CDK4/6抑制剂的治疗中发挥着相应的作用。研究者发现，从CDK4/6抑制剂耐药细胞转移到邻近细胞的外泌体中含有丰富的miR-432-5p，该分子可以通过下调SMAD4抑制TGF-β通路，从而增加CDK6水平，使细胞克服G1阻滞，诱导受体细胞产生CDK4/6抑制剂耐药[25]。

内分泌治疗是雌激素受体（estrogenreceptor, ER）阳性乳腺癌患者的首选治疗方式，但随着治疗的推进，患者常常会出现复发耐药。我们课题组的前期研究显示，乳腺癌微环境中的一群CD63阳性肿瘤相关成纤维细胞可以分泌富含miR-22的外泌体，下调乳腺癌细胞内的ERα表达水平，进而诱导乳腺癌他莫昔芬耐药。正是由于外泌体在乳腺癌耐药过程中发挥着举足轻重的作用，目前也有相应的靶向策略用于逆转乳腺癌治疗耐药。例如，研究者发现，使用含有miR-22 antagomir的纳米颗粒可以有效逆转CD63阳性肿瘤相关成纤维细胞诱导的ERα表达降低和他莫昔芬耐药，为克服乳腺癌内分泌治疗耐药提供了新思路和新靶点[26]。

2.2 外泌体在乳腺癌诊断和治疗中的应用

有效的早期筛查和诊断是改善乳腺癌患者预后和生存期的关键，为此，多种生物标记物包括组织标记物(如ER、PR、HER2、Ki67)、遗传标记物(如BRCA1/2)和血清标记物(CA 15.3、CA549)已被开发用于确定乳腺癌的分子分型、恶性程度和预后[27]。然而，这些标志物的检测要么需要侵入性肿瘤活检，要么无法反应肿瘤的综合信息，使得乳腺癌精准治疗难以实现。作为液体活检的重要组成部分，肿瘤来源外泌体具有稳定性强、组成成分多样、易获得等优点，是很有前景的乳腺癌生物标志物候选成分。越来越多的证据表明，血清外泌体中的组成部分可以在很大程度上反应乳腺癌的恶性程度，预测乳腺癌的治疗效果和预后。Hannafon等[28]利用microRNA测序技术发现，外泌体miR-1246和miR-21在乳腺癌患者血浆中显著升高，且高水平的miR-1246和miR-21与乳腺癌的不良预后密切相关，提示血浆外泌体miR-1246和miR-21是潜在的乳腺癌预测指标，有利于乳腺癌的早期筛查和预后评估。此外，外泌体miRNA也是评估乳腺癌治疗效应的潜在生物标志物。Wu等[29]发现，血浆来源的外泌体miR-375和miR-122可以预测II和III期乳腺癌患者的新辅助治疗反应和乳腺癌复发风险。这些研究表明，来自患者血液样本的外泌体可以作为乳腺癌诊断和治疗反应的潜在临床生物标志物。然而，尽管外泌体作为乳腺癌早期诊断的前景令人兴奋，但目前大多数研究仍缺乏直接证据来证明外泌体的起源和应答细胞中的靶点参与以及外泌体与乳腺癌之间的直接生物学关联。因此，尚需进一步的研究和大数据证据来解释外泌体在乳腺癌患者中的具体作用及其机制，以期获得更好的诊断预测效果。

外泌体在细胞间通讯和肿瘤微环境的建立中发挥着重要作用，因此，中断这种通讯也是治疗乳腺癌的潜在治疗方法。目前，靶向外泌体的治疗方法研究主要集中在外泌体释放、外泌体转运、外泌体摄取以及外泌体中的效应分子等。体外实验表明，外泌体的释放会影响癌细胞中的药物滞留，通过小分子阻断外泌体的分泌可以增加细胞对化疗药物5-氟尿嘧啶的敏感性[30]。研究者在使用CD9或CD63抗体治疗转移性小鼠乳腺癌模型时发现，经CD9或CD63抗体处理的外泌体可以优先被巨噬细胞内化清除，中断外泌体介导的乳腺癌转移过程[31]，提示清除体内肿瘤细胞来源外泌体可能是潜在的癌症治疗策略。我们课题组前期研究也发现，CD63+肿瘤相关成纤维细胞来源外泌体miR-22能够传递给乳腺癌细胞并诱导乳腺癌细胞ERα表达降低和他莫昔芬耐药，而当使用CD63中和抗体或含有miR-22 antagomir的纳米颗粒阻断CD63+肿瘤相关成纤维细胞的诱导耐药作用后，乳腺癌细胞对他莫昔芬治疗的敏感性大大增加，提示该类外泌体是增加乳腺癌内分泌治疗敏感性、克服耐药的潜在靶点[26]。

目前，已有多项临床试验正在进行中，用于评价外泌体作为乳腺癌诊疗的生物标志物的可行性和准确性。例如，一项试验(NCTO2977468)正在确定外泌体是否可以作为三阴性乳腺癌患者对派姆单抗应答的生物标志物。在另一个临床试验(NCTO2662621)中，外泌体HSP70正被用于早期乳腺癌的诊断。在一项多中心前瞻性试验(NCTO3974204)中，研究人员正在探索外泌体的蛋白质组学分析，以预测乳腺癌脑转移风险。由此可见，外泌体作为乳腺癌诊断和治疗生物标志物的潜力巨大，应用前景广泛。

3 总结与展望

当前，关于外泌体调节癌症发生发展的研究正处于大爆发时期。肿瘤来源的外泌体通过改变肿瘤与宿主之间的相互作用，向远端传递有助于乳腺肿瘤的“宏观环境”，而在乳腺肿瘤的“微环境”中，外泌体以旁分泌的方式来参与乳腺癌与相邻基质细胞的相互作用。外泌体作为信息交互的介质，可以介导供受体细胞之间的相互作用，参与调节乳腺癌的生长、转移、血管生成、免疫逃逸和药物耐受等过程，影响着乳腺癌发生发展的每一个环节。外泌体作为生物标志物具有较大的潜力，可用于筛查早期癌症、监测治疗反应和跟踪癌症进展。临床中，外泌体也正在被探索作为纳米级抗癌药物载体，通过操纵其组成和表面蛋白来实现靶向药物传递[32]。然而，基于外泌体的研究还处于起步阶段，进一步的研究对于阐明外泌体在乳腺癌发展中的确切作用至关重要。此外，目前的大部分研究都是在临床前模型中进行的，外泌体在乳腺癌相关临床试验中的特异性和有效性尚未被报道，因此，在未来的研究中，体内研究和临床研究将是探索外泌体在乳腺癌发生发展中的作用的必由之路。

尽管我们对外泌体在乳腺癌中的作用尚缺乏综合的认识和了解，外泌体研究也存在着巨大的技术挑战，但不可否认的是，外泌体在乳腺癌发生发展中的确发挥着巨大的调控作用。同时，当前的证据也充分说明，外泌体相关研究将进一步帮助我们了解乳腺癌的发生发展全过程，并将为乳腺癌的临床诊断和治疗提供新机理和新靶点。