布鲁氏菌病血清学检测方法优缺点对比

王 刚，范伟兴，刘 坤，田丽华，温建新

（1.青岛农业大学动物医学院，山东青岛 266109；2.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；3.青岛西海岸新区动物疫病预防与控制中心，山东青岛 266400）

布鲁氏菌病（brucellosis，以下简称布病）是最常见的人兽共患病之一，其病原为布鲁氏菌（Brucella）。布鲁氏菌是一种短小的球杆状菌，革兰氏染色阴性，主要包括牛种、羊种、猪种、犬种、绵羊附睾种和沙林鼠种，共有19 个生物型[1]。20世纪90 年代，在海洋哺乳动物中还发现了2 种布鲁氏菌，即鳍脚种和鲸种[2-3]。我国将布病列为乙类传染病、二类动物疫病。布病给畜牧业的发展和人类健康带来了很大危害，而有效的检测方法能够为布病的预防、检测和净化提供技术支持。本文重点就布病血清学检测方法的优缺点进行综述，以期为布病检测、诊断和净化提供参考。

1 常规检测方法

目前已经形成了多样化、综合性的布病检验方法，主要包括病原学检测、分子生物学检测（PCR）以及血清学检测。

1.1 病原学检测

通过从病料组织、奶样和其他样品中分离出布鲁氏菌，从而明确感染。病原学检测能够为布病提供最直观的证据，但分离出布鲁氏菌后，需要纯化培养进行生化鉴定，此过程步骤较多，耗时长。而且布鲁氏菌的分离、培养和鉴定需要在专门的P3 实验室（生物安全三级实验室）进行，对试验环境、生物安全要求和试验器材要求较高，难以在基层推广。

1.2 分子生物学检测

利用试剂盒提取样本或直接提取灭活的布鲁氏菌核酸，然后利用PCR 方法进行检测。分子生物学检测也能够为布病的确定提供强有力的证据，敏感性很高，可以同时检测大量样本，检测效率高。但是分子生物学检测需要提取核酸然后进行PCR操作，试剂盒以及引物价格较为昂贵，一般需要耗费几个小时，且对实验室环境有一定的要求，需要在专门的实验室操作，对专业仪器要求较高，也不适合在基层推广应用[4]。

1.3 血清学检测

布病检测中使用最多的方法是血清学检测，与前两种方法相比，大多数血清学检测方法更加简便、省时和廉价。血清学检测适合在基层实验室进行，有些甚至能够在田间进行，在短时间内能够得到试验结果，适合大量样品的检测，对于基层的布病检测确诊具有重要意义。

2 血清学检测方法优缺点

2.1 虎红平板凝集试验（RBT）

RBT是检测布鲁氏菌抗体最常用的方法之一，也是重要的布病检测方法，能够快速诊断动物布病。虎红抗原能够与血清样本中的布鲁氏菌抗体结合，产生凝集现象。将血清样本和虎红抗原充分混匀一段时间后，观察凝集现象并做出判别，从而完成布病检测。RBT 具有很多优点：操作步骤少，操作简便；短时间内即可得到检测结果，节约检测时间；检测试剂价格不高，节约检测成本；检测敏感性较高，具有较高的检出率[5]。RBT 需要用到的试验工具比较简易，仅需要虎红抗原即可完成检测，适用于现场检测，也有利于基层实验室检测。因此，RBT 经常被用于大量样品的布病初筛。但RBT 的检测结果容易受到非特异性抗体的影响，表现为假阳性[6]。为使试验结果偏差较小，采集的血清应该是清亮、无溶血的，且应避免反复冻融，这样就能够消除血清中的纤维蛋白原，从而提高准确性[7-8]。

2.2 试管凝集试验（SAT）

SAT是一种检测血清中布鲁氏菌抗体的方法。布鲁氏菌抗原能够与血清中的IgM 抗体反应产生凝集现象，通过肉眼观察试管中的凝集现象可做出结果判定[9]。SAT 特异性较强，不易受其他干扰因子影响，阳性结果比较准确[10]。但SAT 也存在一定的不足，如每个血清样本需要4 支试管来实现4个梯度的试验，在进行大批量样本检测时，需要大量的试管，试验过程中还需要24 h 的孵育时间，不仅对耗材的需求量较大，且试验时间也较长。而针对不同动物血清（如羊、猪、狗、牛、马、鹿、骆驼等），试验的具体步骤也有所差别。SAT 操作步骤繁琐，且在结果判定时，受人为主观因素影响较大，因此需要与其他检测方法对比，综合判定检测结果[11]。

2.3 全乳环状试验（MRT）

与其他的血清学检测方法不同，MRT 主要通过检测牛奶样本中的抗体来实现布病检测，且一般仅用于奶牛的布病检测，不适用于其他品种家畜。如果待检牛奶样本中存在布鲁氏菌抗体，就会与试验用的红色布鲁氏菌抗原形成复合物，这些复合物会形成紫红色的乳脂环，从而实现布病检测[12]。相比较于其他需要血清的检测方法，MRT 具有一定的优势，无论是单一奶牛的牛奶还是混合的大缸奶，都能实现布病检测，无需采血，不会使奶牛因驱赶、保定、采血等行为产生应激反应，使奶牛产量不受影响，养殖户更容易接受。MRT 的敏感性能够满足大型牛场布病的现场筛查，特异性较强，操作快捷而简便，试剂成本不高，试验结果可靠准确，是一种能够代替SAT 的布病检测方法[13]。但是，如果牛奶样本存放时间较长，或试验温度较高导致牛奶样本腐败，检测结果就可能出现假阳性。当牛奶样本中存在的初乳较多或者混合样本量较大时，也有可能出现一定的假阳性结果。因此MRT 对牛奶样本有一定的要求，需要新鲜、无初乳以及无乳房腺的牛奶。

2.4 酶联免疫吸附试验（ELISA）

用于布病检测的ELISA 有两种：间接ELISA（iELISA）和 竞 争ELISA（cELISA）。iELISA是待检血清样本中的布鲁氏菌抗体与ELISA 板上固定的布鲁氏菌抗原物质结合，利用酶标抗体检测，然后通过底物显色，最后用酶标仪来读值。iELISA 灵敏度较高，标记的抗体较少，成本更低，但是试验周期更长。cELISA 步骤较复杂，但可以检测含有布鲁氏菌抗体的不纯净血清，数据再现性更高，但是整体敏感性和特异性稍低。ELISA 检测布病的敏感性较高，用酶标仪判定试验结果，避免了肉眼观察判定结果的误差，但对专业仪器要求较高，检测试剂比较昂贵，增加了检测成本，此外检测过程中对环境温度的要求也较高，因而限制了ELISA 的使用。

2.5 荧光偏振测定法（FPA）

FPA 是近年来使用越来越广泛的布病检测方法之一。该方法利用了溶液中分子越大旋转速度越慢的原理[14]。将FPA 抗原用荧光分子标记，如果待检血清中有目标抗体，那么抗原和抗体就会结合成更大的分子，结合后的分子旋转速度变慢，用一定角度的偏振光测量旋转时间，此时偏振值如果升高，就说明样品血清呈阳性。FPA 需要专业的荧光偏振仪器，抗原和血清中抗体反应迅速，能够在短时间内检测大量的血清样品，操作比较简单，容易学会，特异性和敏感性与ELISA 相似，但比ELISA 更加节省时间。虽然我国的FPA 技术起步较晚，但是目前已经研发出较为成熟的配套试剂盒，这对我国布病防控具有十分重要的意义[15]。

2.6 补体结合试验（CFT）

待检血清样本中如果有布鲁氏菌抗体，就会与抗原结合，形成抗原抗体复合物，形成的复合物会与补体结合，从而降低了补体反应液的浓度，结果显示为阳性[16]。CFT 的特异性和敏感性都高于SAT，但是CFT 的操作较为繁琐，试验步骤较为复杂，耗时较长，试验要求较高，因此不易普及，应用不广泛[17-18]。

2.7 琼脂扩散试验（NH-GD）

NH-GD 是利用光滑型布鲁氏菌表面的一种天然半抗原来鉴定布病疫苗免疫和野毒感染的方法[19]。布病的检测，不容易区分疫苗因素和野毒感染产生的阳性结果。而NH-GD 能够解决这一问题，且具有很好的特异性和重复性，但抗原的提取和纯化以及试验方法仍需优化。NH-GD 操作技术简便，所需要的试验仪器简单，特别适合在基层推广使用。

3 展望

目前这几种常用的血清学检测方法，为布病的检测提供了多样化的方式。不同的血清学检测方法具有各自的优点，但在实际应用过程中也存在一定的不足。通过对比以上几种血清学检测方法，发现RBT、MRT、ELISA、FAP 和NH-GD 更适合用于布病初筛，而SAT 和CFT 更加适用于复核。

目前布病的血清学检测方法中还没有一种完全具备敏感性高、特异性强、操作简便、检测速度快和检测成本低等优点的检测方法，因此在布病检测的实际临床应用中，常需两种或两种以上的方法相互配合使用，通过对不同检测方法的结果进行比较分析，来综合判断样品的检测结果。除了现有的检测方法外，应该探索更多的新的布病检测方法，例如荧光微球法、半抗原鉴别诊断方法等，以丰富布病的血清学检测技术，优化当前检测方法的不足，让布病的血清学检测更加准确、便捷和高效。