柔嫩艾美耳球虫保守蛋白基因EtCHP40的分子特性研究

姚亚文，赵其平，朱顺海，黄 兵，董 辉，黄文浩,2，刘 展，于 钰，韩红玉

(1.中国农业科学院 上海兽医研究所 农业部动物寄生虫学重点实验室，上海 200241; 2.上海师范大学 生命与环境科学学院，上海 200234)

鸡球虫病是由艾美耳属的几种艾美耳球虫寄生鸡肠道引起的一种危害严重的寄生虫病.临床表现为感染的鸡腹泻、营养吸收不良、饲料转化低、肠道出血和死亡等，对全世界养鸡业造成巨大的经济损失[1].目前控制球虫病的主要方法包括化学药物防治和疫苗免疫预防.现有疫苗主要是由鸡球虫活虫种(株)制备的强毒疫苗和弱毒疫苗，并在产蛋鸡场和部分肉鸡场中应用，但活疫苗存在保存难、散毒及潜在的致病威胁等缺点，使其未能在鸡场得到广泛使用，因此，防治鸡球虫病主要还是依靠药物[2].目前，临床常用的抗球虫药物主要分为离子载体类和化学合成类.离子载体类药物主要包括马杜拉霉素、盐霉素和莫能菌素等，化学合成药物主要包括地克珠利、托曲珠利和氨丙啉等[3].由于药物的长期广泛使用导致鸡球虫对药物产生严重的耐药性[4].目前，几乎从现场分离到对所有使用的抗球虫药产生耐药性的虫株，而且出现了多重或交叉耐药性虫株，随着耐药性的产生，抗球虫药的使用年限大为缩短，防治效果逐渐降低甚至失效[5].因此，研究了解鸡球虫耐药性的产生机制及建立耐药性快速检测方法，是急需解决的重要问题.自发现鸡球虫对抗球虫药产生耐药性以来，各国学者对鸡球虫产生耐药性的原因机制进行了研究，但至今尚未弄清楚鸡球虫耐药性产生的分子机理，也未找到控制球虫产生耐药性的靶基因，无法解释鸡球虫耐药性产生的分子机制.

研究发现鸡球虫耐药性的发生机制十分复杂，可能与核苷酸碱基序列的突变、基因表达水平的变化以及表观遗传学如甲基化修饰等有关[6].在对其它顶复们原虫和鸡球虫耐药性的研究发现，与敏感株相比，耐药株的部分基因出现显著的上调或下调.如研究发现临床分离的对锑耐受的杜氏利什曼原虫(Leishmaniadonovani)，其体内表面抗原2基因的表达量升高[7].Thabet等采用LC-MS/MS相对蛋白组学定量方法对柔嫩艾美耳球虫(Eimeriatenella,Et)敏感株和田间分离的莫能霉素耐药株进行比较分析，发现97个差异蛋白，其中25个蛋白在耐药株表达上调[8].同样，利用cDNA微阵列技术对柔嫩艾美耳球虫莫能霉素耐药株和马杜拉霉素耐药株与敏感株进行分析发现敏感株和耐药株基因的转录存在差异[9].

为研究鸡球虫耐药性产生的分子机制，实验室前期采用药物浓度递增法从柔嫩艾美耳球虫敏感株诱导出柔嫩艾美耳球虫地克珠利耐药株和柔嫩艾美耳球虫马杜拉霉素耐药株.之后对两株耐药株和敏感株进行转录组测序分析，获得耐药株与敏感株的差异表达基因，其中柔嫩艾美耳球虫保守蛋白40(Conserved hypothetical protein, EtCHP40；基因号：ETH_00025040)在马杜拉霉素耐药株中转录水平显著上调[10].本文对该保守蛋白基因进行克隆，成功构建重组表达质粒，并在大肠杆菌诱导表达重组蛋白，通过荧光定量PCR和间接免疫荧光等实验，对该蛋白分子特性进行初步分析，为进一步研究其功能及与鸡球虫耐药产生的关系提供基础.

1 材料与方法

1.1 动物和细胞

试验所用三黄鸡购自上海奉贤区某种鸡场，新西兰大白兔购自上海嘉根生物公司.鸡胚成纤维细胞系(DF-1)来源于东兰辛系(EL-0)鸡胚，由中国农业科学院上海兽医研究所动物原虫病创新团队球虫组传代并保存.

1.2 虫株

试验所用鸡球虫虫株均由中国农业科学院上海兽医研究所动物原虫病创新团队球虫组分离传代并保存.分别为柔嫩艾美耳球虫药物敏感株(DS)，柔嫩艾美耳球虫地克珠利耐药株(DZR)，柔嫩艾美耳球虫马杜拉霉素耐药株(MRR)，柔嫩艾美耳球虫盐霉素不同浓度耐药株(15ppm，30ppm，45ppm，60ppm，SMR)，田间鸡球虫混合株(A1)和单卵囊分离的田间柔嫩艾美耳球虫盐霉素耐药株(S2，S3，S4，S5)[11-12].

将1日龄三黄鸡，在无球虫环境下饲养7天，检查无球虫感染后，经口服的方式接种柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊(5万/鸡)，一周后收集盲肠，收集纯化未孢子化卵囊(Unsporulated Oocysts, UO)和孢子化卵囊(Sporulated Oocysts, SO)[13-14].通过对纯化的孢子化卵囊体外脱囊，消化，纯化和回收子孢子(Sporozoites, SZ)[15].第二代裂殖子(second generation Merozoite, ME)在鸡接种孢子化卵囊后112h从鸡的盲肠粘膜中收集和纯化[16].

1.3 试剂

RNA提取试剂TRIzol和M-MLV反转录试剂盒购自美国Invitrogen公司.DL2000 DNA Marker、PCR Master Mix、DNA胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒均购自于上海天根生物科技有限公司.pGEM®-T Easy载体购于美国Promega公司.限制性核酸内切酶BamHⅠ、XhoⅠ、去除基因组DNA试剂盒和DNA纯化试剂盒购自于宝生物工程(大连)有限公司.弗式完全佐剂、弗氏不完全佐剂、抗荧光猝灭剂、抗α-Tubulin单克隆抗体和蛋白酶抑制剂均购自于美国Sigma公司.胎牛血清、细胞基础培养基(DMEM)、青霉素和链霉素、预染蛋白Marker和SuperSignalTMWest Pico Plus化学发光底物试剂盒购自于美国Thermo Scientific公司.BCA蛋白浓度测定试剂盒和DAPI(4’,6’-diamidino-2-phenylindole)购于上海碧云天生物技术有限公司.硝酸纤维素膜(PVDF)购自于Milipore公司.HRP标记山羊抗鼠IgG和HRP标记山羊抗兔IgG购自于美国Proteintech公司.FITC标记抗兔IgG购自Jackson Immuno Research公司.

1.4 cDNA模板的制备和基因克隆

使用RNA提取试剂TRIzol从柔嫩艾美耳球虫敏感株孢子化卵囊提取总RNA，经1%核酸凝胶电泳及紫外分光光度计检测所提总RNA的浓度和纯度，用M-MLV反转录酶试剂盒反转录合成单链cDNA第一链.实验所用器具均是无核酸酶器具，所有实验过程均在无核酸酶环境中进行.

根据保守蛋白EtCHP40基因(基因号：ETH_00025040)的开放阅读框，利用Primer6.0设计特异性引物，上游引物为：5’-GCGGATCCATGCTGTGTCCGGTAGCGACAGG-3’(BamHⅠ)；下游引物为：5’-GCCTCGAGTCACAACTCCACTCCATCATTGCG-3’(XhoⅠ).以柔嫩艾美耳球虫敏感株孢子化卵囊cDNA第一链为模板，扩增目的片段(预计长度约为519bp).将得到的PCR产物胶回收后克隆到pGEM®-T Easy载体上，并转化至大肠杆菌E.coliTOP10感受态细胞中，进行蓝白斑筛选.挑选白色菌落进行菌液PCR鉴定后测序.

1.5 生物信息学分析

利用NCBI上的BLAST程序(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)对EtCHP40基因序列进行比对和分析，利用ProtParam工具(http：//cn.expasy.org/tools/protparam.html)计算编码该保守蛋白氨基酸组成、理论分子量、等电点等.利用TMHMM服务器(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)和SignalP4.0(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)分析EtCHP40基因编码的蛋白是否存在跨膜结构和信号肽序列.采用Motifscan(http：//myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motifscan)分析EtCHP40氨基酸序列含有的功能结构域.

1.6 重组蛋白的表达、纯化和多克隆抗体的制备

提取测序正确的重组克隆质粒pGEM-EtCHP40，将pGEM-EtCHP40和pET-28a空载体经BamⅠ和XhoⅠ双酶切后回收目的片段，4℃连接过夜，将连接成功的重组表达质粒命名为pET-28a-EtCHP40.PCR和测序鉴定正确后将重组质粒转化于大肠杆菌E.coliBL21感受态细胞中，用1.0mmol/L异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达，菌液超声后进行SDS-PAGE电泳，瞬篮染色液染色，确定重组蛋白(rEtCHP40)是否表达，且表达形式为可溶表达或包涵体.对得到的包涵体重组蛋白进行切胶分离纯化，经BCA蛋白浓度测定试剂盒测定浓度，-20℃保存备用.

将0.2mg纯化的rEtCHP40用等量体积的弗氏完全佐剂乳化，之后将其皮下免疫体重约2.5kg新西兰大白兔.2周后将等量的重组蛋白和弗氏不完全佐剂乳化，每隔一周注射免疫一次，共4次.最后一次免疫后7天，采集血液，分离血清并在-20℃保存.

1.7 Western blot

将纯化后的重组蛋白进行SDS-PAGE，并将其转印到PVDF膜上，于5%(密度)脱脂牛奶中，4℃封闭过夜.经0.05%(体积分数)PBS-Tween20缓冲液(PBST：1% PBS中加入1‰的Tween20)洗涤3次后，分别用抗HIS单抗(1∶5000稀释)、兔阴性血清(1∶100稀释)和兔抗子孢子血清(1∶100稀释)作为一抗，37℃孵育2h，PBST洗3次，每次10min，最后一次洗涤后用1∶5000比例稀释的HRP标记山羊抗鼠IgG和HRP标记山羊抗兔IgG作为二抗，常温下孵育45min，PBST洗涤3次后，用SuperSignalTMWest Pico Plus化学发光底物试剂盒检测结果.

1.8 实时荧光定量PCR

为了研究基因EtCHP40在柔嫩艾美耳球虫敏感株4个不同发育阶段、柔嫩艾美耳球虫马杜拉霉素耐药株、柔嫩艾美耳球虫地克珠利耐药株、柔嫩艾美耳球虫盐霉素不同浓度耐药株、田间鸡球虫混合株(A1)和单卵囊分离的田间柔嫩艾美耳球虫盐霉素耐药株的mRNA转录水平，分别提取这些虫株的总RNA，利用去除基因组DNA试剂盒去除基因组DNA后，用M-MLV逆转录酶试剂盒将虫体总RNA反转录成单链cDNA，再利用DNA纯化试剂盒纯化cDNA作为模板.利用Primer6.0设计特异性引物，上游引物为5’-GCACTGGTGGAGGGAAACTA-3’，下游引物为：5’-GGAAGTCTCTGCACCCTCAG-3’.并用18S RNA作为内参[22-23]，其上游引物为：5’-TGTAGTGGAGTCTTGGTGATTC-3’，下游引物为：5’-CCTGCTGCCTTCCTTAGATG-3’，采用实时荧光定量PCR(qPCR)技术，对EtCHP40在柔嫩艾美耳球虫敏感株4个不同阶段，不同耐药株和田间株的mRNA转录水平进行分析.每个反应进行3次重复，用2-ΔΔCt的统计学方法计算相对mRNA的转录水平.

1.9 间接免疫荧光定位

将收集纯化的子孢子和裂殖子重悬于1% PBS中，稀释为6×104个/mL，将子孢子和裂殖子均匀铺在细胞爬片上，置于6孔板中风干.按每孔接种2.5×105个DF-1细胞将其均匀加入到细胞培养6孔板中，培养12h.按每孔7.5×105个新鲜的子孢子加入到含DF-1细胞的6孔板中，在37℃、5%CO2下继续培养.分别在子孢子入侵细胞后2、24、48和72h各取出一个细胞板，用4%细胞固定液固定0.5h，将固定液洗去后加入0.1% Triton X-100通透30min；用PBST洗涤5次，每次5min，用2%牛血清白蛋白(BSA)在37℃下封闭2h，PBST洗涤5次；加入稀释在1% PBS中的兔抗rEtCHP40抗体(1∶100稀释)，37℃孵育1h后洗去一抗，加入FITC标记的抗兔IgG(1∶500稀释)，37℃孵育1h，PBST洗涤5次；用10μg/mL DAPI室温下避光染色30min，PBST洗涤5次；用抗荧光猝灭剂封闭，荧光显微镜(德国Zeiss，LSM880)下观察结果.

2 结 果

2.1 EtCHP40基因的克隆和生物信息学分析

以柔嫩艾美耳球虫敏感株孢子化卵囊cDNA第一链为模板，对EtCHP40基因的ORF序列进行扩增，琼脂糖凝胶电泳显示得到与目标序列大小(519bp)一致的PCR扩增条带.将目的条带纯化后连接到克隆载体pGEM-T Easy载体构建重组克隆质粒pGEM-T-EtCHP40，经PCR鉴定后测序，BLAST分析结果显示该序列与已知的柔嫩艾美耳球虫EtCHP40基因(GenBank：XM_013373672.1)序列100%同源.生物信息学分析显示该基因序列编码172个氨基酸，预测分子量为18.8kDa，理论等电点为4.77.对预测的氨基酸序列分析表明，该基因编码的蛋白无信号肽和跨膜结构.蛋白质结构预测结果(图1)表明，EtCHP40含4个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点(位置为：45～48，74～77，94～97，121～124)；2个N-豆蔻酰化位点(位置为：102～107，125～130)；1个蛋白激酶C磷酸化位点(位置为：94～96)；1个真核生物和病毒天冬氨酸蛋白酶活性位点(位置为：125～136)；1个逆转录病毒型家族天冬氨酸蛋白酶活位点(位置为：123～137).

图1 EtCHP40基因cDNA核苷酸序列及其氨基酸序列的生物信息学分析

2.2 重组蛋白的诱导表达与多克隆抗体的制备

将重组表达质粒pET-28a-EtCHP40转化至大肠杆菌E.coliBL21感受态细胞中，诱导重组蛋白His-EtCHP40(rEtCHP40)表达，SDS-PAGE电泳结果表明成功诱导了重组蛋白的表达，且该重组蛋白表达形式为包涵体，切胶纯化后经SDS-PAGE电泳检测表明，得到了比较纯的、分子量约30kDa的融合蛋白(图2(a)).Western blot分析发现：以稀释后的抗His标签单抗和抗子孢子多克隆抗体作为一抗孵育重组蛋白，均可在约30kDa处检测到目的条带，但是重组蛋白rEtCHP40与兔阴性血清无反应条带，表明不与阴性兔IgG发生反应(图2(b)).说明该重组蛋白rEtCHP40具有良好的反应原性.

图2 重组蛋白rEtCHP40的纯化及反应原性分析

2.3 EtCHP40基因在柔嫩艾美耳球虫敏感株4个不同发育阶段的mRNA转录水平

利用实时荧光定量PCR方法对在柔嫩艾美耳球虫敏感株4个不同发育阶段(未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子和第二代裂殖子)的mRNA转录水平进行分析，结果表明EtCHP40在柔嫩艾美耳球虫敏感株不同发育阶段中的转录水平存在差异，且该基因在第二代裂殖子转录水平最高，未孢子化卵囊阶段次之；孢子化卵囊和子孢子两个阶段都比较低(图3).

图3 EtCHP40基因在虫体不同发育阶段的转录水平

2.4 EtCHP40基因在柔嫩艾美耳球虫敏感株和不同耐药株的转录水平

对柔嫩艾美耳球虫敏感株与不同耐药株中EtCHP40基因的mRNA转录水平进行分析，结果显示与敏感株相比，该基因在3个耐药株(MRR、DZR和SMR)中mRNA转录水平显著上调，其中在马杜拉霉素耐药株转录最高，差异极显著(P<0.001)(图4(a))

通过比对敏感株与不同浓度盐霉素耐药株的相对转录水平，发现随着药物浓度的升高，EtCHP40的mRNA转录水平不断升高，60ppm的盐霉素耐药株与敏感株相比存在显著差异(P<0.001)(图4(b)).田间混合株A1与单卵囊分离的4株柔嫩艾美耳球虫盐霉素耐药株的EtCHP40基因mRNA转录水平与敏感株相比，均存在显著差异(P<0.05)(图4(c)).

图4 (a)EtCHP40基因在不同耐药株的转录水平;(b)EtCHP40基因在不同浓度盐霉素耐药株的转录水平;(c)EtCHP40基因在田间株的转录水平

2.5 蛋白EtCHP40在虫体上的定位分析

使用兔抗rEtCHP40多克隆抗体作为一抗，对柔嫩艾美耳球虫敏感株子孢子、裂殖子和子孢子入侵DF-1细胞后虫体不同发育阶段的EtCHP40蛋白进行定位分析.荧光显微镜观察EtCHP40蛋白在虫体上的分布.结果显示该蛋白主要位于子孢子的表面和顶部(图5(a))；当子孢子入侵DF-1细胞前期EtCHP40仍位于虫体的表面与顶部(图5(c))；当虫体发育至滋养体时，该蛋白主要位于细胞质中，且荧光强度增强(图5(d))；当虫体发育至未成熟裂殖体和成熟裂殖体时，该保守蛋白EtCHP40较均匀的分布于整个虫体(图5(e、f))，荧光强度减弱；而当虫体发育至第二代裂殖子时，蛋白EtCHP40均匀的分布在整个虫体(图5(b)).

图5 EtCHP40在虫体上的定位

3 讨 论

实验室前期对柔嫩艾美耳球虫敏感株、地克珠利耐药株和马杜拉霉素耐药株进行了转录组测序分析，获得了耐药株与敏感株的差异表达基因，这些差异表达基因可能参与了柔嫩艾美耳球虫对抗球虫药的耐药过程，对耐药株与敏感株差异表达基因的特性和功能进行分析，有助于理解球虫耐药性产生机制和建立球虫耐药性快速检测方法.

3.1 EtCHP40蛋白含有多个功能结构域

本研究成功克隆了EtCHP40基因，序列分析显示EtCHP40基因编码的蛋白含有酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、N-豆蔻酰化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、真核生物和病毒天冬氨酸蛋白酶活性位点和逆转录病毒型家族天冬氨酸蛋白酶活位点.酪蛋白激酶Ⅱ(CKⅡ)是一种高度保守的、在各种真核生物中都广泛存在，并且具有多种生理功能的磷酸化丝氨酸/苏氨酸的激酶.CKⅡ主要通过T细胞受体、细胞因子受体执行信号传导功能；受体酪氨酸激酶具有跨膜结构，可与胞外配体结合，引起结构改变并产生酶催化活性，又可选择性的与底物结合使其磷酸化，受体酪氨酸激酶及其配体很多都与肿瘤相关[17-18].蛋白激酶C是钙离子和磷脂酰丝氨酸依赖性蛋白激酶，未受刺激的细胞中以非活化的形式存在于胞浆，活化后可介导跨膜信号传导和增强特殊基因的转录，拥有广泛的作用底物，可参与细胞分泌、肌肉收缩、细胞增殖和分化等众多生理过程[19].天冬氨酸蛋白酶是一类在酸性pH下有活性的蛋白水解酶，广泛分布于真核生物以及微生物中，所有哺乳动物的天冬氨酸蛋白酶都是以酶原的形式合成，然后再被激活为有功能的活性形式，主要功能是降解蛋白、抗原和促进其他酶的活化等[20].对免疫缺陷病毒蛋白酶(HIV PR，C34.2316)的研究发现，HIV PR的活性发生改变能够造成HIV复制和感染其他细胞的能力发生紊乱，这使得HIV PR在药物治疗中已成为一个首选的药物受体[21]，这提示EtCHP40基因可能是一个鸡球虫药物的受体.该蛋白这些磷酸化位点和糖基化位点的存在，提示着该保守蛋白在细胞内经过了一系列的加工修饰，可能通过蛋白的磷酸化和去磷酸化，在细胞信号转导过程中发挥着重要作用.

3.2 EtCHP40可能参与了虫体的生长发育及逃避宿主的免疫反应

对重组蛋白rEtCHP40进行SDS-PAGE和反应原性分析发现，原核表达获取的重组蛋白rEtCHP40分子量比我们预期大，推测可能是由于His-tag中的碱性氨基酸的作用造成蛋白在SDS-PAGE中迁移变慢，而导致的偏差[22]，反应原性的结果表明该重组蛋白可用于多克隆抗体的制备.

本研究通过qPCR的方法检测了EtCHP40基因在柔嫩艾美耳球虫4个不同发育阶段的转录水平，发现EtCHP40基因在第二代裂殖子与未孢子化卵囊阶段的转录水平较高，特别是第二代裂殖子阶段远高于其他阶段，而孢子化卵囊和子孢子阶段转录水平较低.第二代裂殖子与未孢子化卵囊是在鸡肠道内发育的，此时的虫体需要从宿主细胞内获取更多的营养物质来发育繁殖，同时也需要逃避宿主的免疫反应，本文推测不同发育阶段表达量的差异可能是体内与体外不同的环境引起的.有研究发现，环境的变化，如冷、热、化学因素与营养因素等都会导致蛋白表达的变化[23].因此，推测EtCHP40在裂殖子阶段和未孢子化卵囊的高表达可能参与了虫体的生长发育繁殖和逃避宿主的免疫反应，并可能参与了能量的代谢.刘桂玲等对柔嫩艾美耳球虫表面抗原10的研究发现，它在裂殖子高表达与虫体的生长发育有关[24].此外，陈婷等人在对柔嫩艾美耳球虫3-磷酸甘油醛脱氢酶的研究中也发现其在裂殖子阶段的高表达会为其发育提供能量支持.

通过间接免疫荧光定位研究发现该保守蛋白主要位于子孢子的表面和顶部，这可能与虫体入侵宿主细胞有关.研究报道柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原1(AMA1)蛋白位于子孢子的表面和顶端，针对AMA1的抗体可有效抑制子孢子对宿主细胞的入侵[25].翟颀等对分布在子孢子顶端的柔嫩艾美耳球虫保守蛋白EtCHP39研究发现，其抗体在体外也能有效抑制子孢子入侵DF-1细胞[26].同样，本文也进行了抗体体外抑制实验，结果发现用兔抗rEtCHP40预处理子孢子并不影响入侵DF-1细胞，因此推测该蛋白可能并不直接参与子孢子入侵宿主细胞，可能参与了虫体与宿主的相互作用以及虫体逃避宿主的免疫反应.

3.3 EtCHP40与柔嫩艾美耳球虫耐药的关系

通过荧光定量PCR方法检测了EtCHP40基因在柔嫩艾美耳球虫敏感株与不同耐药株和田间株的mRNA转录水平，发现该基因在耐药株中表达显著上调，且与盐霉素药物浓度呈正相关，推测其表达水平的高低可能受到药物浓度的影响.同样，分析野生混合种耐药株和单卵囊分离的盐霉素耐药株的EtCHP40基因mRNA转录水平，发现与敏感株相比，不管是混合种还是分离的柔嫩艾美耳球虫盐霉素耐药株，其表达水平都是显著上升的，尽管与实验室诱导的对盐霉素完全耐药的虫株相比存在一定的差异，这可能是因为田间分离的耐药株对药物的敏感性不同，导致了其表达水平的不一致.已有研究发现，在耐药的寄生虫体内有些蛋白出现高表达.如对杜氏利什曼原虫耐药性的研究发现对葡萄糖酸锑耐受的杜氏利什曼原虫虫体中富含半胱氨酸的蛋白高表达[27].Doliwa等利用差异凝胶电泳分析弓形虫磺胺嘧啶耐药株和敏感株的蛋白差异，发现耐药株中蛋白磷酸酶的表达量显著升高[28].

造成某一特定基因表达水平出现差异的原因有很多，可能是基因自身位点突变引起的，也有可能是其上游基因或其他相关基因发生突变或者自然选择下发生连锁效应使其表达水平发生变化.如在对疟原虫耐药性的研究中发现恶性疟原虫氯喹抗性基因(Pfcrt)中某些单核苷酸突变与氯喹耐药相关.对恶性疟原虫中耐青蒿素的虫株分析发现pfkelch13基因某些位点的突变导致其构象改变，使其下游基因磷脂酰肌醇-3激酶(PfPI3K)的表达量增加，导致PfPI3K效应分子磷脂酰肌醇-3-磷酸(PI3P)的水平升高，从而诱导其对青蒿素产生耐药性[29].EtCHP40基因在柔嫩艾美耳球虫耐药株中表达上调是因其自身出现突变引起还是由于上游基因突变引起的还需要进一步研究.