食品中米酵菌酸测定方法研究进展

(董宪兵 赵 博 周纯洁 候美玲 吴彦蕾

(重庆市食品药品检验检测研究院，重庆 401121)

椰毒伯克霍尔德菌可以产生两种毒素，分别是米酵菌酸(Bongkrek acid)和毒黄素(Toxoflavin)，两者共同导致了中毒症状，米酵菌酸的毒性更强。米酵菌酸是一种热稳定的高度不饱和的三羧酸脂肪酸，具有很强的生物活性，是椰毒假单胞菌引起食物中毒和死亡的主要毒性代谢产物，在20世纪30年代，由荷兰学者Merten和Vanveen发现[1]。米酵菌酸基本无味，很难察觉，其耐热性极强，即使用100℃的开水煮沸或用高压锅蒸煮也不能破坏其毒性，进食后即可引起中毒。多种食物如自制谷类发酵食品、银耳和木耳等易受椰毒假单胞菌污染而产生米酵菌酸毒素，食用含有该毒素污染的食物会引起人或动物中毒，目前对米酵菌酸尚无特效解毒药物，一旦中毒，病死率在40%～100%。近年来，我国发生过多起因食用含有米酵菌酸的食品导致中毒死亡的事件。如2012年山东省临沂市，2014年云南文山州，2018年广东省东莞市，2020黑龙江均发生食用被米酵菌酸污染的食品导致的中毒死亡事件[2-5]。因此，对食品中米酵菌酸的检测是不可或缺的。目前，对食品中米酵菌酸的检测方法主要有薄层色谱法、紫外分光光度法、液相色谱法、液相色谱串联质谱法以及近年来发展起来的液相色谱串联质谱/质谱法、超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法等。

1 食品中米酵菌酸检测方法

1.1 薄层色谱法

薄层色谱法是将吸附剂或支持剂在玻璃或塑料板涂一薄层，将待分析样品滴加到薄层上，然后用适当的溶剂展开而达到分离，鉴定和定量分析的目的，具有样品需求量少，设备要求简单和检测速度快等优点[6]。薄层色谱法多用于食品中生物活性的测定、蜂蜜的鉴别、生物碱成分分析等领域[7-9]。早期国内外学者把薄层色谱法应用到米酵菌酸的测定，胡文娟等[10]对酵米面和银耳中的米酵菌酸的提取和薄层分离条件进行了研究，建立了测定酵米面和银耳中的米酵菌酸的薄层色谱法。HU等[11]用交联葡聚糖LH-20凝胶过滤和C-18反相柱层析法从玉米粉中分离出米酵菌酸，并用薄层色谱法进行识别和分析。薄层色谱法对食品中米酵菌酸测定的应用较早，但是因其步骤复杂，灵敏度低，不适合大批量样品的检测而逐渐被其他检测方法替代。

1.2 分光光度法

分光光度法测定食品中的米酵菌酸，以其操作简单，仪器价格低廉为主要特点，是实验室分析使用的分析方法。2018年马忠宾等[12]建立了紫外分光光度法测定食品中的米酵菌酸，并申请了相关专利，该方法用氨水甲醇溶液作为提取溶剂，处理粉碎后的样品加入溶剂经震荡、超声、提取、分液加入碳酸氢钠溶液分离，加入石油醚分离后浓缩，最后用甲醇溶解后在紫外分光光度计上比色进行测定。阎立荣[13]应用线性组合导数的统计学方法建立了能同时测定米酵菌酸和毒黄素的分光光度法，此方法克服了各种组分波长严重重叠时难以测定的困难，具有选择性强，精密度好的优点。黄建立[14]用紫外分光光度法测定变质银耳中米酵菌酸含量，并与高效液相色谱法的测定结果进行对比，结果表明测定结果无显著差异。但是分光光度法在测定食品米酵菌酸中存在专属性差，灵敏度低的缺点。

1.3 高效液相色谱法

高效液相色谱法测定食品中的米酵菌酸应用研究非常广泛，GB 5009.189—2016 《食品安全国家标准 食品中米酵菌酸的测定》中也是用高效液相色谱法测定米酵菌酸，但国标测定范围适用于银耳及其制品、酵米面及其制品，其他食品类别中的米酵菌酸的测定还没有相关的标准，而且该标准方法前处理过程繁琐、有机试剂消耗量大，难以实现样品批量处理。俞穗珍[15]在参照标准的方法基础上，通过优化的固相萃取方法，提取工艺，进样量的大小，选择流动相pH 值大小，探索出更加快速、便捷、准确的方法来测定新鲜银耳中的米酵菌酸，缩短了样品前处理周期，减少了有机试剂的消耗量，节约了成本。侯佰立[16]应用固相萃取技术并结合高效液相色谱仪建立了固相萃取-高效液相色谱测定食品中米酵菌酸残留的方法，该方法用甲醇和氨水作为提取溶剂，经混合型强阴离子固相萃取柱净化，浓缩过滤后用高效液相色谱仪在267 nm紫外波长处进行分析。结果表明米酵菌酸测定结果在一定线性范围内线性良好，R2为0.999 7，回收率高。李红艳等[17]通过考察样品的不同提取条件和不同固相萃取柱的净化效果，建立了混合型弱阴离子固相萃取富集净化，高效液相色谱-二极管阵列检测器快速测定食品中米酵菌酸残留的方法。该方法以80%乙腈水为提起溶剂，经WAX固相萃取小柱净化，以269 nm为分析波长进行分析，米酵菌酸在0.1～40 mg/L质量浓度范围内线性良好,相关系数r值大于0.999。石声鑫[18]比较了不同提取溶剂和不同萃取工艺对食品中米酵菌酸提取效率的影响，建立了高效液相色谱-二极管阵列检测器测定食品中米酵菌酸残留的方法。苏永恒[19]优化了液相色谱的色谱条件、提取和净化条件，建立了固相萃取-高效液相色谱方法测定食品中米酵菌酸含量，可满足食品中米酵菌酸含量的检测要求。周霞[20]采用C18色谱柱，以甲醇和1%乙酸为流动相，检测波长为267 nm，建立混合型强阴离子(MAX)全自动固相萃取富集净化，超高效液相色谱法快速检测食品中米酵菌酸残留量。但高效液相色谱法分析时间较长，易受样品基质干扰致使定性定量出现偏差，对低浓度样品定性能力不够，样品取样量较大。

1.4 高效液相色谱-串联质谱法

随着检测行业的飞速发展，超高效液相色谱-串联质谱法的应用越来越普及。相对液相色谱法，超高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)前处理更加简单，分析时间短，专属性好，灵敏度高，适合大批量样品的快速检测。苏肯明[21]采用甲醇：0.02 M乙酸铵缓冲溶液(85∶15)为流动相，用电喷雾负离子源(ESI-)进行离子化，多反应监测扫描(MRM)对米酵菌酸的母离子及子离子进行监测，建立了液相色谱-串联质谱法测定银耳中的米酵菌酸的新方法。周鹏[22]把粉碎后的银耳样品用甲醇提取，混合强阴离子交换固相萃取柱(PAX)净化，UPLC BEH C18(2.1×100 mm,1.7 μm)色谱柱分析，以10 mmol/L乙酸铵-乙腈为流动相，梯度洗脱，串联四级杆质谱多反应监测负离子模式检测，基质匹配外标法定量，建立了快速测定银耳中米酵菌酸的超高效液相色谱串联质谱分析方法。曾令浩[23]建立高效液相色谱-串联质谱法快速检测银耳中的米酵菌酸的方法。银耳样品用甲醇提取后，超声振荡，离心分层，上清液用甲醇定容。使用空白基质液配置标准曲线对结果进行校正，在优化后的色谱及质谱条件下，采用负离子模式进行电离，并通过多反应监测模式对目标化合物的定量离子和定性离子进行测定。覃冬杰[24]建立超高效液相色谱-串联质谱法测定柳州螺蛳粉中米酵菌酸的分析方法，该方法通过优化色谱和质谱方法(色谱柱、流动相、质谱条件)、提取条件(提取溶剂的选择)、净化条件的选择，并设计正交试验得到最佳的螺蛳粉中的米酵菌酸的测定方法。曾雪芳[25]研究了不同基质米粉和河粉中的米酵菌酸的测定方法，试样经提取，净化，浓缩及过滤后，以0.1%甲酸水和乙腈作为流动相进行梯度洗脱，采用电喷雾离子源负模式检测，外标法定量。基于米酵菌酸色谱和质谱行为的研究，对其仪器测定条件进行优化，并对优化后的方法进行方法学验证，结果表明该方法灵敏度高，专属性好，准确可靠，适用于米粉和河粉基质中米酵菌酸的测定。李红娜等[26]建立了用液相色谱与飞行时间质谱联用测定配方米粉中米酵菌酸的方法，该方法快速简单。用高效液相色谱串联质谱法测定米酵菌酸不仅在食品领域得到广泛应用，在中药和刑侦检验领域都得到了广泛的应用[27-29]。

1.5 超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱

随着检测技术的不断发展，质谱技术的广发应用，相对于常规的超高效液相色谱-串联质谱法使用多反应监测模式通过目标物的离子对进行定量分析，超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱(UPLC-Q-OrbitrapHRMS)具有分辨率高及定量能力好的优点，利用目标物母离子的精确分子量直接定量，无需对目标物逐个优化子离子及相关参数，对于多目标物分析可以极大地降低检测方法的时间，同时又能很好地避免低分辨质谱易受基质干扰而产生假阳性的现象[30，31]。针对目前测定米酵菌酸的前处理过程均需要使用混合型阴离子固相萃取柱进行净化，耗时长、溶剂消耗大的问题，梁明[32]建立了QuEChERS+EMR-Lipid结合超高效液相色谱-四极杆_静电场轨道阱高分辨质谱快速测定河粉中的米酵菌酸的方法，该方法采用 QuEChERSEMR-Lipid技术对样品进行净化，可以大大缩短前处理时间。并且选用高分辨质谱对处理后的样品进行测定，提高方法的准确性和灵敏度。此方法大大缩短前处理时间，提高食品中米酵菌酸的检测分析效率。 Liang等[33]应用纳米管技术结合高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱建立了米粉中米酵菌酸的测定方法，并设计了响应面对前处理方法进行了优化，结果表明该方法适用于米粉中米酵菌酸的测定，回收率为79.8%～102.6%，相对标准偏差(RSD)为4.2%～7.1%。超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法简化了分析步骤，提高了分析效率和检测准确性，但是该方法配套仪器购买成本较高，仪器后期维护保养成本较高，使该方法的推广普及受到一定的限制。

2 结论与展望

近年来食品中米酵菌酸污染而引发的中毒事件时有发生，目前国内对米酵菌酸污染的监管还处于比较薄弱的环节，许多学者对米酵菌酸的测定方法进行了大量研究，并且不断的改进。随着监管部门对米酵菌酸污染问题的重视，米酵菌酸污染将会纳入监管范畴，但是目前只有GB 5009.189—2016这一项食品安全国家标准，该标准应用液相色谱法对米酵菌酸测定，该方法样品需求量较大，前处理步骤复杂，溶剂消耗量大。目前，急需开发更加快速、准确的检测方法将成为该领域重点研究方向之一。随着实际检测需求和技术水平的不断提高，色谱检测技术已经逐渐由低分辨向高分辨方向发展，以满足建立高灵敏度、高选择性、高分析通量、简便快速实用分析方法的需要。