新型冠状病毒血清特异性抗体不同检测方法的临床应用评价

张俊华，李富荣，杨文贵，王进云，金哲宇，马瑛龙，任 峥，朴文花

新型冠状病毒肺炎(COVID-19)疫情已成为全球关注的焦点，早期诊断并及时管控是阻止疫情进一步播散和控制新感染线索的关键[1]，因此，及时筛查并确诊感染仍是当前实验室检测面临的首要任务。核酸检测阳性是疑似患者确诊的“金标准”，但其对实验场地及操作人员均有较高要求，而且检测结果易受标本质量、病毒感染部位及表达量等众多因素影响，新冠病毒血清学抗体检测可在一定程度上弥补核酸检测对于检测条件要求较高的局限性[2-3]，对于疫情防控来说，可为核酸检测提供一个重要的补充协同手段，在《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(第七版)》中，抗体检测已经被纳入确诊方法之一[ 4]。本实验旨在补充研究血清学抗体检测在新型冠状病毒肺炎(COVID-19)的方法学差异，分别利用血清学抗体的胶体金免疫层析法(GICA)、酶联免疫吸附法(ELISA)、化学发光法( CLIA)检测新型冠状病毒血清学特异性抗体，为实验室检测新型冠状病毒肺炎提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料：本研究采集了宁夏回族自治区21例核酸检测阳性的COVID-19确诊病例(2020年2月10日-3月12日收治)26份血清标本，21个病例中有5个病例采集了不同时期的双份血清标本，血清收集时间最早为发病后第22天，最晚为发病后第53天。此外还补充检测了16例康复随访患者，病例年龄范围为7～67岁，平均年龄35岁，其中男性7例，女性9例。阴性血清标本来自宁夏回族自治区人民医院及宁夏回族自治区人民医院筛查的排除新冠肺炎患者为对照组，共计30份，确诊及对照标本参照《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(第七版)》。

1.2 试剂与方法

1.2 1 试剂：①胶体金免疫层析法检测试剂：A为国产某品牌新型冠状病毒(2019-nCoV)抗体胶体金法检测试剂盒，包括两类检测试剂，其中A1试剂为新型冠状病毒(2019-nCoV)IgM抗体胶体金法检测试剂,批号为20200205，有效期至2020/11/04；A2试剂为新型冠状病毒(2019-nCoV)抗体IgG胶体金检测试剂,批号为20200208，有效期至2020/11/09。B为国产某品牌新型冠状病毒(2019-nCoV)抗体(IgG/IgM)胶体金法检测试剂，批号为W19500304,有效期至2020/10/04；C为国产某品牌新型冠状病毒(2019-nCoV)抗体(IgG/IgM)胶体金法检测试剂，批号为2005120410，有效期至2020/11/02。②酶联免疫吸附法检测试剂：D为国产某品牌新型冠状病毒(2019-nCoV)(IgG/IgM)抗体酶联免疫吸附法检测试剂，批号为20200205，有效期至2021/2/20。③化学发光法检测试剂：E为新型冠状病毒(2019-nCoV)抗体测定试剂盒(化学发光微粒子免疫检测法)，注册证号20203400198，批号20200521，有效期至2020/11/4。不同试剂基本特征见表1。

表1 不同检测试剂性能特征

1.2.2 胶体金免疫层析法：严格按照试剂使用说明书操作，肉眼观察显示结果判定。判读阳性：在检测区及质控区各出现 1 条反应线；判读阴性：仅在质控区出现1条反应线；判读无效：质控区无反应线出现，或仅在检测区出现1条反应线，表明检测无效。

1.2.3 酶联免疫吸附法：操作严格按试剂盒操作说明书进行，设定酶标仪于450/630 nm处用空白孔调零，测定各孔吸光光度(OD)值。结果判定：临界值(cut off)=阴性对照平均OD值×2.1(阴性对照孔值低于0.05者按0.05计算)，阴性对照孔OD值<0.10，阳性对照孔OD值>0.80，否则试验无效。阳性判定：样品OD值≥临界值(cut off)者为2019-nCov抗体阳性；样品OD值<临界值(cut off)者为2019-nCov抗体阴性。

1.2.4 化学发光微粒子免疫检测法：运用化学发光微粒子免疫检测法测定，加入预激发液与激发液后测量产生的化学发光反应信号，以相对发光单位(RLU)表示。样本中存在的2019-nCoV抗体量与系统检测的RLU成正比。样本S/CO≥1.0时，视为对2019-nCoV抗体呈反应性。实验操作步骤均按说明书严格进行操作。

1.3 主要仪器：酶标仪(郑州安图全自动酶标分析仪)。

1.4 统计学方法：采用SPSS 20.0统计软件，不同检测方法诊断的准确性采用敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值、漏诊率、误诊率、约登指数进行描述。

2 结果

2.1 不同试剂盒检测血清学抗体结果：采用不同检测方法的六种试剂盒(A1、A2、B、C、D、E)检测56例血清样本，其中四种GICA法检测试剂(A1、A2、B、C)敏感性为69.2%～80.7%；特异性为96.7%～100.0%；阳性预测值95.2%～100.0%，阴性预测值为78.9%～85.7%；漏诊率和误诊率分别为19.2%～30.8%和0.0%～3.3%，约登指数为0.69～0.81；ELISA及CLIA检测试剂(D、E)敏感性分别为92.3%和96.2%，特异性及阳性预测值可达到100.0%，阴性预测值分别是93.8%和96.8%，漏诊率分别为7.7%和3.9%，误诊率为0.0%，约登指数分别为0.92和0.96。不同试剂盒检测能力评价表，见表2。

表2 不同试剂盒检测血清学抗体的能力评价

2.2 16例康复期患者血清IgM和IgG抗体阳性率比较：16例血清标本中16号、18号标本IgM和IgG抗体均为阴性，13号、22号、25号、26号标本检测结果为IgM(+)IgG(-)，19号标本检测结果为IgM(-)IgG(+)，其余9例标本(距发病时间26～37 d)检测IgM和IgG抗体结果均为阳性，见表3。

2.3 三种检测方法灵敏度比较：CLIA检测血清按1∶512倍稀释时，检测仍为阳性(1号、3号、4号、5号标本)，而ELISA检测阳性最大稀释倍数为1∶256(5号标本)，GICA检测阳性最大稀释倍数为1∶128(2号标本)，5例标本阳性检出率随样本稀释滴度的增加而降低，化学发光法检测2019-nCoV总抗体灵敏度高于其他两种方法，酶联免疫吸附法次之，见表4。

表3 16例康复期患者血清IgM和IgG抗体阳性率比较

表4 3种方法学检测试剂C/D/E对5例阳性标本梯度稀释结果

3 讨论

核酸检测作为COVID-19确诊标准，具有灵敏度高、特异度好、可早期诊断等优点[5]，但相关研究表明，新型冠状病毒核酸检测对于确诊阳性病例的检出率仅为30%～50%[6]，血清特异性抗体检测可以满足对疑似病例快速筛查的要求，是实验室诊断的重要手段。抗体的检测对于病毒确诊及感染时间、评估病毒的感染阶段并预测疾病转归具有重要意义[7-8]。

本研究分别利用GICA、ELISA、CLIA三种检测方法对2019-nCoV病毒血清特异性抗体进行检测，比较6种试剂盒对COVID 19 患者的抗体阳性检出率差异，其中ELISA与CLIA诊断试剂准确性较高。在GICA检测试剂中，总抗体检测的约登指数高于单独检测IgM和 IgG，在各项评价指标中的结果高于IgM和IgG检测试剂盒，在临床使用GICA试剂的过程中，建议使用总抗体检测试剂或将IgG与IgM抗体联合检测，以保证灵敏度和特异性，降低因假阳性和假阴性带来的漏诊和误诊[9]。

同时，在本次实验中发现金标法试剂检测灵敏度低于其他检测方法，会有漏检和误检现象，建议多种检测方法联合使用。胶体金法检测试剂中，针对新冠病毒抗体IgM和IgG，联合检测相比抗体IgM的单项检测更具优势，可对新冠肺炎患者疾病发展过程的不同阶段进行全覆盖，从不同维度完善对新冠病毒肺炎疑似患者的辅助诊断，在一定程度上提高患者的阳性检出率[10]。

通常病原体感染机体后产生的特异性IgG抗体晚于IgM抗体，新冠病毒感染者特异性IgG抗体在发病后第1周的阳性率较低(3.7%～42.9%)，第2周的阳性率逐渐上升到43.5%～76.0%[11]。但也有研究报告，特异性IgG抗体阳性率在第2周能达到90.0%以上。新冠病毒特异性IgG抗体水平在发病后第3～4周迅速上升并达到峰值，阳性率为80.0%～100.0%，在第5～7周特异性IgG抗体阳性率可维持在100.0%[12-13]。GICA相同品牌试剂盒分别检测16例康复随访患者IgM和IgG抗体，病例距发病时间23～37 d (3～5周)，2019-nCoV IgM抗体有14例阳性，2例阴性患者不排除IgM抗体水平下降所致，2019-nCoV IgG抗体检测10例阳性，4例阴性，分析抗体检测差异和假阴性可能与试剂盒本身检测差异有关，也可能与病毒的感染机制有关，有待进一步研究。

通过5例阳性血清的梯度稀释实验，CLIA结合了高灵敏的化学发光测定方法与高特异的抗原抗体反应，其敏感性上高于ELISA及GICA两种方法。此外，不同新冠患者抗体滴度水平差异表明个体感染病毒状况不同或机体免疫应答存在差异，在康复患者血浆用于治疗前进行抗体滴度的检测以保证疗效是非常必要的。

本研究仅为初步探索，客观原因导致较少的实验标本量使得纳入病例数较少，且样本连续性不足，研究采用的部分胶体金法和ELISA法试剂均为用于科学研究的试剂，而不是用于病例诊断，因此可能存在试剂质量问题导致假阴性或假阳性。同时，新型冠状病毒对于其血清中抗体产生时间及其消长规律还处于探索研究阶段，在疫情防控过程中，仍然需要大量的抗体检测数据以推动病毒的流行病学调查。因此血清学抗体检测暂时不能作为新冠肺炎确诊和排除的唯一依据，国家卫生健康委临床检验中心张瑞等从新型冠状病毒特异抗体检测的假阳性角度出发，认为特异性IgM/IgG抗体检测不适用复工等一般人群的筛查[14]，血清学抗体检测可以作为核酸检测阴性疑似病例的补充检测指标，通过核酸、抗体检测联合应用，可以缩短检测窗口期，提高阳性检出率，有利于病例的发现、诊断以及疫情的防控。