口蹄疫A型病毒不同毒株抗原反应性

孙燕燕，陈夏辉，李 昕，林 密，李峰松，贺华丽，包艳芳，杨 光，蒋 韬* (.中国农业科学院 兰州兽医研究所 家畜疫病病原生物学国家重点实验室/口蹄疫国家参考实验室,甘肃 兰州 730046；2.甘肃农业大学 动物医学院，甘肃 兰州 730070)

口蹄疫A型病毒(FMDV)由北部国家传入我国，主要于20世纪70年代中期以前在国内大部分地区流行，并且一直呈散发流行态势。近几年，根据国家口蹄疫(FMD)参考实验室疫情监测分析，我国A型FMDV流行毒株主要为A型Sea-97[1-3]。为了应对可能出现的A型FMD突发事件，避免FMD 的大规模流行，疫苗免疫在该病防控中具有重要地位[4-6]。从现有疫苗对流行毒株的保护性来看，被免疫的动物所产生的抗体能够有效抵抗FMDV感染，而且免疫抗体的中和滴度与攻毒保护有着很好的相关性[7-9]，据此中国兽医药品监察所和国家FMD 参考实验室联合开展了A型AF/72毒株、Re-A/WH/09毒株疫苗免疫攻毒试验，结果表明两种疫苗均对当前流行的A型病毒有效[2]。为准确评估畜群的免疫状态，制定合理有效的防预方案，本研究分别选择AF/72、Re-A/WH/09(属于A/Sea-97 G1)和A/GD/MM/13(属A/Sea-97 G2)株用作备选毒株，通过对不同毒株纯化146S抗原以及VP1表达蛋白的抗原反应性进行比较试验，选择适宜的病毒株作为检测用抗原。关于FMDV疫苗株抗原性的比较，目前只针对其免疫原性进行过研究，而对其生产用毒株之间抗原反应性的比较尚未见到报道[10-12]。本试验为了验证不同A型毒株与田间血清的免疫学反应，首次选取FMDVAF/72株、Re-A/WH/09株146S纯化抗原及其VP1表达蛋白、A/GD/MM/13株VP1表达蛋白作为检测用诊断抗原，通过实验室建立的间接ELISA方法和胶体金免疫层析检测方法(GICA)方法，对其进行敏感性与特异性评价试验，筛选出反应性最高的检测用抗原，为选择更优良的FMDV免疫学诊断抗原提供科学依据，对促进疫病的预防及监测工作的发展有积极的作用[13-14]。

1 材料与方法

1.1 试验材料AF/72株、Re-A/WH/09疫苗株抗原；原核表达经纯化复性后的FMDV AF/72株、A/WH/09株、A/GD/MM/13株VP1蛋白分别由GenScript公司和研究所内课题组合成并表达纯化；两种FMD A型毒株(AF/72、Re-A/WH/09)疫苗免疫阳性血清(AF/72和Re-A/WH/09免疫血清各30份)60份、FMD O型阳性血清15份、FMD Asia1型阳性血清10份和FMD 阴性血清15份，共计100份；阳性标准对照(Pc)血清1份(LPB-ELISA抗体效价1∶128)、阴性标准对照(Nc)血清1份(LPB-ELISA抗体效价<1∶8)。

1.2 主要试剂和仪器辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗牛IgG抗体、兔抗羊IgG抗体、兔抗猪IgG抗体均购自Sigma公司；氯金酸购自Sigma公司；其他试剂均为分析纯。超速离心机购自Thermo Fisher公司；XY3000点喷仪、CM3000切条机均购自美国Bio-Dot公司；TP-1900紫外可见分光光度计购自北京普析公司。

1.3 FMDV AF/72株、Re-A/WH/09疫苗株抗原146S的制备将灭活好的FMDV AF/72株、Re-A/WH/09疫苗株进行差速、超速离心后再用于150～450 g/L蔗糖密度梯度离心，用紫外分光光度计测定D260值。

1.4 FMDV AF/72株、A/WH/09株、A/GD/MM/13株VP1蛋白纯化与鉴定由GenScript公司对AF/72株、A/WH/09株和A/GD/MM/13株进行毒株VP1原核表达，AF/72株的表达载体为PET-30a(+)，A/WH/09株、A/GD/MM/13株的表达载体为PET-21a(+)，均经His tag柱纯化。经纯化复性的VP1蛋白进行SDS-PAGE电泳，分离的蛋白带电转至PVDF膜。使用30 g/L的明胶溶液于37℃封闭1 h，PBST充分洗涤，加V(血清)∶V(封闭液)=1∶500倍稀释的A 型FMDV阳性牛血清，37℃孵育1 h，PBST洗涤6次，每次3 min，再加血清∶封闭液=1∶1 000稀释的HRP标记兔抗牛IgG，37℃孵育1 h，PBST洗涤6次，每次3 min，增强化学发光法(ECL)显色，待出现条带后定影，观察特异性条带。

1.5 诊断抗原活性比较用传统间接ELISA法[5]，用包被液(20 mmol/L Na2CO3,20 mmol/L NaHCO3,pH9.6)分别稀释纯化的FMDV AF/72株、Re-A/WH/09株纯化的146S病毒抗原以及AF/72株、A/WH/09株、A/GD/MM/13株VP1表达蛋白至1 mg/L，按常规方法包被、封闭及干燥酶标板(表1)。将样品稀释液100 μL/孔加入酶标板中，再加Pc和Nc各10 μL/孔混匀，37℃保温30 min，充分洗涤后每孔加入酶标抗体100 μL，37℃保温30 min，充分洗涤后加入底物液显色10 min，2 mol/L硫酸终止反应，酶标仪读D450值。计算2种抗原各自的Pc和Nc的值之比(P/N)，PcD450值均为0.4左右时，P/N值越高其反应活性越好[6]。

表1 活性比较所用抗原组合列表

1.6 诊断抗原反应性分析

1.6.1间接ELISA方法建立 将活性较高的几株抗原分别用0.05 mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6)稀释到0.50 mg/L的质量浓度后100 μL/孔包被酶标板，PBST洗涤6次，每次3 min(表2)。加入封闭液300 μL/孔，37℃封闭1 h后PBST洗涤同上。待检血清、阳性和阴性对照血清按照1∶50稀释，100 μL/孔，60 min后PBST洗涤同上。最适稀释度的酶标二抗100 μL/孔，45 min后PBST洗涤同上。加入TMB底物显色，100 μL/孔，10 min后加入终止液100 μL/孔终止反应，酶标仪读取D450值。判定标准：血清样本抗体效价(S/P)=(D450值样品-D450值阴性)/(D450值阳性-D450值阴性)，当效价≥0.30，判定为阳性；效价<0.25，判定为阴性。效价0.30～0.25判为可疑，2次可疑结果判定为阴性。

表2 反应性分析所用抗原组合列表

1.6.2间接ELISA方法对不同抗原免疫反应验证 通过A型间接ELISA方法检测100份FMDV 不同毒株疫苗免疫阳性血清、FMD O型、Asia1型阳性血清和阴性血清。根据阴、阳性检出率确定不同毒株诊断抗原的免疫反应性。

1.6.3GICA方法建立 按最适量分别向胶体金溶液中加入间接ELISA检测结果中反应性较高的AF/72株、Re-A/WH/09株纯化146S病毒抗原，磁力搅拌15 min(表3)。再分别加入10%BSA至终浓度为1%，搅拌15 min后，移至离心管，经8 000 r/min离心10 min，小心吸弃上清。将沉淀悬浮于1/10初始胶体金体积的金胶缓冲液中，即为免疫胶体金。将制备好的2种免疫胶体金分别用点喷仪设置工作喷涂量，并喷涂于玻璃纤维纸，制成金标垫。再用pH7.4 0.02 mol/L PB缓冲液分别将AF/72毒株和A/WH/09毒株的纯化抗体及146S抗原调整至工作浓度，喷涂于NC膜作为试纸条C线和T线，置37℃烘干30 min。将2种金标垫与2种NC膜搭配，制备胶体金检测试纸条。

表3 免疫层析检测法建立所用抗原组合列表

1.6.4GICA方法对不同抗原免疫反应验证 通过2种免疫层析试纸条检测100份FMDV 不同毒株疫苗免疫阳性血清、FMD O型、Asia1型阳性血清和阴性血清。根据阴、阳性检出率确定不同毒株诊断抗原的免疫反应性。

2 结果

2.1 FMDV AF/72株、Re-A/WH/09疫苗株抗原146S含量将D260>0.4的部分合并，即为合格的FMDV-146S抗原。根据公式146S(mg/L)=128.7×D259计算146S含量，结果可得AF/72株146S的含量为55.10 mg/L，Re-A/WH/09株146S的含量为48.32 mg/L。

2.2 AF/72株、A/WH/09株、A/GD/MM/13株病毒VP1蛋白鉴定结果对纯化复性的3株FMDV蛋白VP1 进行Western blot 鉴定，均可见在目的大小处出现特异性反应条带(图1)，表明重组蛋白 pGEX-6p-1-VP1 能与豚鼠抗 A 型FMD 阳性血清发生特异性结合，不能与豚鼠抗O型和Asia1FMD 病毒血清反应，说明这3株VP1 蛋白都具有相对特异的生物活性。

M.蛋白Marker；1.VP1蛋白 SDS-PAGE；2.VP1蛋白Western blot

2.3 不同毒株抗原活性的比较应用直接ELISA方法，用不同类型相同浓度的A型抗原包被ELISA板，再分别以抗 FMDV AF/72株、Re-A/WH/09株纯化146S病毒抗原以及AF/72株、Re-A/WH/09株、A/GD/MM/13株VP1表达蛋白Ab为一抗，测定D450值，当阴性对照值<0.2、样品P/N>2.10判定为阳性，而阳性的最高稀释浓度判定为抗原与血清反应作用效价(图2)。抗AF/72株146S-Ab与其抗原反应P/N为5.49，抗Re-A/WH/09株146S-Ab与其抗原反应P/N为3.81，抗AF/72株VP1表达蛋白Ab与其抗原反应P/N为2.86，抗Re-A/WH/09株VP1表达蛋白Ab与其抗原反应P/N为2.21，抗A/GD/MM/13株VP1表达蛋白Ab与其抗原反应P/N为1.95，可以看出A/GD/MM/13株抗原活性最低，不适合作为诊断抗原使用。

图2 不同毒株抗原活性的比较分析

2.4 不同抗原建立间接ELISA方法检测血清样本试验分析用纯化AF/72株、Re-A/WH/09株146S抗原和VP1蛋白建立间接ELISA方法验证100份检测血清(图3)。试验发现a组和b组抗原包被酶标板用ELISA方法检测100份田间血清时，对于不同毒株免疫的A型阳性血清其阳性检出率分别为90.00%和86.67%；对于异型血清和阴性血清检出率分别为95.00%和87.50%，检测效果敏感性高，特异性好。c组和d组抗原包被酶标板检测时敏感性与特异性均低于a组和b组，检测效果不理想，不适合作为诊断用抗原。

图3 不同抗原建立间接ELISA方法检测结果比较

2.5 不同抗原建立GICA方法检测血清样本分析检测100份血清样本时，结果发现a组试纸条检测A型样品呈明显阳性结果，但检测O型、Asia1型阳性血清时，会出现弱阳性结果，检测效果不理想；b组试纸条检测时与各类阳性血清时均发生阳性反应，灵敏度和特异性无明显差别；c组试纸条对于不同毒株免疫的A型阳性血清的敏感性为95.00%；对于异型血清和阴性血清的特异性为92.50%(图4)，检测效果敏感性高，特异性好；d组试纸条对于不同毒株免疫的A型阳性血清的敏感性为88.33%；对于异型血清和阴性血清的特异性为87.50%(图4)，较c组试纸条灵敏度稍弱，特异性稍差，可以采用，但鉴于两者在纯化时，FMDV AF/72株抗原的收获量较Re-A/WH/09株抗原的更多，浓度更高，因此选用AF/72株制备试纸条。

图4 不同抗原建立GICA方法检测结果比较

3 讨论

测定血清中FMDV特异性抗体可用于检测疫苗接种后的抗体水平，观察免疫效果以及毒株之间的抗原性比较等方面[15-16]。已有资料显示对FMDV疫苗免疫原性进行过研究，而对诊断用毒株之间抗原反应性的比较尚未见到报道[17-18]。因此，根据FMDV流行情况，试验设计将AF/72、Re-A/WH/09和A/GD/MM/13 3种毒株的全病毒抗原及其VP1表达蛋白作为备选抗原，最终筛选出AF/72株146S抗原具有最佳活性与反应性。这与FMDV的结构存在很大关系。FMDV的免疫原性主要取决于完整病毒粒子(146S)，它可诱导产生型特异性中和抗体[9]。而表达抗原多选用FMDV某一段基因序列。同时利用原核或真核系统表达，产生的蛋白与天然蛋白构象差异很大，特别是抗原决定簇重要的糖基化位点不能得到很好的修饰，使其免疫原性较差，不能很好的产生中和抗体，这也是现在多数重组抗原不能替代全病毒抗原作为疫苗生产的原因[10]。而作为诊断动物免疫或感染产生中和抗体水平的检测抗原，其必须具备充分的抗原决定簇和完整构象位点才能更好的捕获血清中的抗体，并与其进行特异性反应，以提高其检测的灵敏度[19-21]。同时，146S抗原作为纯化天然病毒抗原，能提供表达抗原不具备的可针对病毒血清型特异性的位点[22]。因此，全病毒抗原有较好的反应活性。

据文献记载，从现有疫苗对流行毒株的保护性来看，中国兽医药品监察所和国家FMD 参考实验室联合开展了A型AF/72毒株、Re-A/WH/09毒株疫苗免疫攻毒试验，结果表明2种疫苗均对当前流行的A型病毒有效[1]。从抗原活性与反应性分析可以看到2种毒株各具有优势。AF/72具备良好的反应性、特异性。Re-A/WH/09作为改造毒具有更为广谱的反应性，但使用时与O型阳性血清、Asia1型阳性血清有交叉反应。作为诊断用抗原，需同时兼顾抗原反应性与特异性，尤其是面对国内市场O型流行情况复杂，O型疫苗类型多、接种区域普及率高，各级疫控免疫抗体检测数量多的情况[23]。对于A型诊断抗原的选择，应具备较好的特异性，才能有效分析不同型疫苗对动物的保护情况，为防疫监测提供正确的分析数据。

作为FMD的防控要求，以及病害的流行监测，目前已经建立了多种FMDV及其抗体的检测方法。常用抗原检测方法主要有病毒分离、PCR、抗原捕获ELISA等。血清学诊断方面，现在检测结构蛋白抗体的方法主要是病毒中和试验(VNT)、ELISA和GICA等[12]。其中ELISA方法更加特异、敏感、高效，大多数实验室在前期研究中常用ELISA方法替代VNT方法。而GICA方法以其快速、简便、适合大规模群体检测等特点，成为FMD 诊断的最常用方法。本研究选择AF/72毒株、Re-A/WH/09毒株纯化146S抗原及其VP1表达蛋白、A/GD/MM/13毒株VP1表达蛋白作为备选诊断抗原，分别建立ELISA与GICA方法，根据对田间血清样品的检出率，分析抗原反应性的高低。结果显示纯化的146S全病毒抗原在间接ELISA和GICA 2种方法中均表现出较高的敏感性与特异性，但对于不同毒株在纯化过程中的收获量及浓度有所不同。本试验中AF/72株146S含量较Re-A/WH/09株146S高，且纯化过程更简单，将其作为诊断抗原的最佳备选所建立的诊断方法对预防和控制FMD 的发生及流行具有十分重要的意义。