mgrB和mcr-1在耐多黏菌素猪大肠杆菌中的作用

邝启红，李文娅，李垠树，贾雅婷，胡功政，苑 丽 (河南农业大学 动物医学学院，河南 郑州 450046)

多黏菌素是一种广谱抗革兰阴性菌的阳离子多肽，主要用于治疗多重耐药革兰阴性菌感染，尤其是产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌导致的感染。近年来，耐多黏菌素的肠杆菌科细菌日益增多，导致人医和兽医临床防控耐药革兰阴性菌感染更加困难。目前已阐明多黏菌素的耐药机制主要有2种：染色体介导的双组分信号转导系统PmrAB和PhoPQ的表达量升高及其上游阻遏蛋白MgrB的特异性突变和质粒介导的多黏菌素耐药基因mcr[1-2]。mcr基因具有磷酸乙醇胺转移酶活性，细菌产mcr后会导致菌体内磷酸乙醇胺合成增多，从而修饰类脂A，并最终导致细菌对黏菌素耐药[1]。MgrB是一种47个氨基酸编码的跨膜蛋白[3]，是MgrB-PhoPQ-PmrHFIJKLM信号通路中的负性调控蛋白[4-5]，可通过抑制PhoQ组氨酸激酶的活性，阻遏磷酸基团转移给PhoP，从而抑制下游操纵子的表达[6]。近来有研究表明：mgrB基因的缺失、变异、插入或截断失活以及mgrB启动子区突变或插入失活，都会导致PhoPQ系统和pmrHFIJKLM操纵子过表达[7-9]，进而造成细菌对多黏菌素耐药。

细菌的mgrB基因变异或携带mcr基因都会导致其对多黏菌素耐药，但目前尚不清楚在耐多黏菌素大肠杆菌中这两种机制存在的差异。本试验对收集的165株猪源大肠杆菌采用微量肉汤稀释法测定多黏菌素的敏感性，并对耐药菌株的mcr-1～mcr-5基因以及mgrB基因进行检测及测序比对分析，进而评估mgrB和mcr-1在大肠杆菌对多黏菌素耐药的贡献，为防控多黏菌素耐药的传播和延缓耐药趋势提供试验数据和依据。

1 材料与方法

1.1 菌株和质粒165株大肠杆菌由本实验室于2016—2017年自安徽、河南、湖南、湖北、江西、山西、陕西7省不同地区猪病料样本(肠、肺脏、淋巴、脾脏、肝脏等)和健康猪肛门拭子采集分离保存；大肠埃希菌ATCC25922(购自中国普通微生物菌种保存中心)为质控菌；pBAD/HisA质粒(由本实验室保存)具有氨苄西林抗性。

1.2 主要试剂和药品LB肉汤、LB琼脂等培养基均购自北京奥博星生物技术有限责任公司；质粒小提试剂盒和DNA胶回收试剂盒购自美国OMEGA公司；Primer STAR高保真酶，XholⅠ和Hind Ⅲ内切酶，T4DNA连接酶和荧光染料Mix等均购自TaKaRa公司；DL2000、DL5000 Marker为北京擎科新业生物科技有限公司产品；氨苄西林钠购自北京索莱宝科技有限公司；多黏菌素(含量90%)是由河南牧翔动物药业有限公司提供。

1.3 菌株复苏取甘油保存的菌种并充分振荡，按1∶100比例无菌接种于3 mL新鲜的LB肉汤，置于37℃振荡培养12 h，用无菌接种环蘸取一环菌液划线接种于LB琼脂平板上，倒置于37℃温箱中培养12 h，后挑取单个菌落接种于LB肉汤，37℃振荡培养12 h后备用。

1.4 质粒提取pBAD/HisA质粒的提取按照美国OMEGA公司的质粒小量提取试剂盒说明书进行，将收集的液体置于-20℃保存。

1.5 药物敏感性测定

1.5.1药液的配制 用分析天平称取多黏菌素和氨苄西林钠适量，无菌配制为5 120 mg/L，0.22 μm滤膜过滤分装至1.5 mL EP管中，置于-20℃保存备用。

1.5.2MIC值测定 采用微量肉汤稀释法[10]测定多黏菌素对165株猪大肠杆菌的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concertration,MIC)，结果按照美国临床实验室标准化协会(CLSI)标准判读，大肠杆菌ATCC25922为质控菌。

1.6 多黏菌素耐药基因的检测

1.6.1菌株DNA提取 采用常规煮沸法[11]提取各菌株的DNA，-20℃保存备用。

1.6.2引物设计 根据GenBank公布的mgrB核苷酸序列，应用primer 5.0分析软件设计引物，mcr-1～mcr-5引物序列参考相关文献，由上海生物工程有限责任公司合成。其中,mgrB-F/mgrB-R包含mgrB基因及其上游启动子区，引物序列见表1。

表1 多黏菌素耐药基因PCR扩增的引物序列

1.6.3多黏菌素耐药基因比对分析 PCR检测并测序分析耐药猪源大肠杆菌的mcr-1～mcr-5流行情况。mgrB基因全序列及其启动子区经PCR扩增后，产物经胶回收、纯化后，用T4DNA Ligase 4℃过夜连接至pBAD/HisA质粒，连接产物用化学转化法转入DH5α感受态细胞，用引物mgrB-F/mgrB-R进行PCR验证，并提取重组质粒经XhoⅠ和Hind Ⅲ双酶切鉴定，送至上海生物工程股份有限公司测序，测序结果用DNAStar软件分析，以大肠杆菌K-12 MG1655为参照菌，进行同源性比对分析。

2 结果

2.1 猪大肠杆菌对多黏菌素的敏感性测定多黏菌素对165株猪大肠杆菌的MIC值分布见图1，其中147株(89.1%)对多黏菌素耐药，MIC的范围为4～32 mg/L，且MIC=16 mg/L时菌株数最多，有82株。MIC值≤1 mg/L共有18株，敏感率为10.9%。

图1 165株猪源大肠杆菌对多黏菌素的MIC值分布

2.2mcr耐药基因的鉴定PCR检测耐多黏菌素猪大肠杆菌的mcr-1～mcr-5基因。结果显示，147株耐多黏菌素的猪大肠杆菌中除EPF25菌未检出mcr基因外，其余146株菌都仅携带mcr-1基因(图2)，所有菌株均未检出mcr-2～mcr-5基因。

M.DL2000 DNA Marker；1～20.部分多黏菌素耐药菌；21.阳性对照；22.阴性对照

2.3mgrB基因的突变将mgrB基因及其启动子区连接pBAD/HisA载体并转入感受态细胞DH5α后，提取重组质粒，PCR鉴定扩增出预期大小的片段并经XhoⅠ和HindⅢ双酶切证实为mgrB-pBAD/HisA重组质粒(图3)。

M.DL5000 DNA Marker；1.pBAD/HisA；2～4.pBAD/HisA-mgrB

以大肠杆菌K-12MG1655(GenBank号：NZ_CP014348.1)为参照菌株，mgrB基因经PCR检测并测序比对分析。结果表明,mgrB启动子区变异的有104株(70.7%，104/147)，且均携带mcr-1基因，其中99株菌有相同的碱基突变位点，均为mgrB编码区上游12 bp处的A→G碱基；3株菌(E176、E186、E224)含2个碱基突变位点：编码区上游12 bp 处的AG碱基和27 bp处的C→T碱基突变；E193菌(编码区上游44 bp处G→A碱基突变)和EPD04菌(编码区上游38 bp处C→G碱基突变)仅含1个突变位点，且与上述不同。mgrB编码区氨基酸突变的有11株(0.07%，11/147)，其中仅有EPF25菌不含mcr基因；有6株菌(EPA05、EPA06、EPA09、EPA25、EPA27和EPD11)均为33位的谷氨酰胺突变为精氨酸，有3株菌(E8、E180、E221)是31位的天冬氨酸突变为甘氨酸，EPD23菌为33位的谷氨酰胺突变为组氨酸，EPF25菌为42位的天冬酰胺突变为丝氨酸。代表性菌株mgrB基因及其启动子区序列已提交至NCBI，获得的GenBank序列号见表2。比较多黏菌素对受试菌的MIC值及耐药菌mcr-1基因、mgrB变异之间的关系发现它们之间的相关性不明显，猪大肠杆菌对多黏菌素耐药是由于mcr基因和mgrB变异共同作用的结果。

表2 耐多黏菌素的大肠杆菌mgrB(与K-12MG1655相比)的突变位点

3 讨论

近年来，mgrB基因的突变、缺失或者插入序列在多黏菌素耐药肺炎克雷伯菌中已有报道，且已被证明在肺炎克雷伯菌黏菌素耐药中起重要作用[4,14-15]。大肠杆菌多黏菌素耐药机制的相关研究主要集中于质粒介导的mcr基因[8,16]。肺炎克雷伯菌的mgrB启动子区插入类IS903序列可引起mgrB表达量显著下降，从而导致PhoPQ系统和pmrHFIJKLM操纵子过表达，最终使该菌对多黏菌素表现耐药[17]。同时，OLAITAN等[18]在患者中分离的耐多黏菌素肺炎克雷伯菌中的mgrB启动子区也发现IS903插入序列。HAEILI等[19]在mgrB启动子区发现IS插入序列。但有关mgrB启动子区碱基突变的相关报道尚未见。本研究在多黏菌素耐药的147株菌中检测到104株mgrB启动子区碱基突变，推测mgrB启动子区突变可能会导致mgrB基因表达减少，进而导致PhoPQ系统上调，降低大肠杆菌对多黏菌素的敏感性，但尚须要进一步研究证实。

本试验结果表明有11株耐多黏菌素猪大肠杆菌的mgrB编码区氨基酸发生突变，且以往研究已证明这3处氨基酸突变与细菌对多黏菌素耐药相关。EPF25菌的mgrB基因发生N42S突变，该突变与DAGHER等[20]在黎巴嫩医院中分离的耐多黏菌素阴沟肠杆菌的mgrB基因中的突变相同；2017年，POIREL等[21]也在耐多黏菌素动物源肺炎克雷伯菌中的mgrB中发现了N42Y突变。2019年，HUANG等[22]从中国食用动物收集的大肠杆菌分离株中检出mgrB基因的D31G突变，该突变也同样发生在本试验的E8、E180和E221等3菌株中。2019年，KIM等[23]在韩国猪源大肠杆菌mcr基因阴性分离株中检出mgrB的Q33R突变，而本试验在大肠杆菌EPA05、EPA06、EPA09、EPA25、EPA27和EPD11等6株菌中检出存在同样的氨基酸突变。推断mgrB基因的31、33和42位的氨基酸突变与细菌对多黏菌素产生耐药密切相关。

2018年，ZHANG等[24]发现当肺炎克雷伯菌中因mgrB失活而呈现对多黏菌素高度耐药后，既使该菌株再获得mcr-1基因也不会引起其对多黏菌素耐药程度的改变，故猜测失活的MgrB可能掩盖了mcr-1基因的功能。而齐小梅等[7]在大肠杆菌耐药菌中未检测到mgrB突变，并认为大肠杆菌对黏菌素耐药的主要原因是获得mcr-1基因。本试验比较多黏菌素对受试菌的MIC值及耐药菌mcr-1基因、mgrB变异之间的关系发现它们之间的相关性不明显，说明猪大肠杆菌对多黏菌素耐药是由于mcr基因和mgrB变异共同作用的结果。