不同浓度胆固醇对NEFA诱导的肝脂沉积的影响

赵莹莹，张冰冰，王 爽，麻芯茹，李 铭，郭 寒，徐 闯*，杨 威* (.黑龙江八一农垦大学 动物科技学院，黑龙江 大庆 6339；.黑龙江八一农垦大学 生命科学技术学院，黑龙江 大庆6339)

非酒精性脂肪肝疾病是危害人类乃至畜禽的重要疾病，高脂饮食以及能量负平衡下脂肪动员所致的高非酯化脂肪酸(NEFA)血症是导致脂肪肝的主要病因。大量NEFA在肝脏会产生过量甘油三酯(TG)，而肝脏以极低密度脂蛋白(VLDL)的形式排除甘油三脂的能力不足最终导致肝脂蓄积，胆固醇(CHO)作为VLDL的重要组成部分，肝细胞内CHO水平的变化对高NEFA所致的肝脏蓄积的影响特征尚不清晰。CHO是机体重要的营养物质，它可促进脂肪运输、参与细胞膜的形成、还是合成胆汁酸及类固醇激素的重要前体物，并对维持机体内稳态发挥重要作用。体内CHO主要来源于食物摄取和机体内自身的生物合成，肝脏是其合成代谢的主要场所[1]。CHO主要在肝脏内质网上合成，NEFA的肝脏代谢产物乙酰辅酶A是其合成的前体物，合成过程中需要ATP供能。肝脏中CHO以游离形式存在，部分游离CHO与活化的酰基辅酶A酯酰基结合形成CHO酯，胆固醇酯则以VLDL形式分泌到血浆；部分游离CHO也能通过转化为胆汁酸，随胆汁排出流入小肠[2]。研究指出能量负平衡下高浓度NEFA所致肝脂蓄积与CHO合成不足进而影响VLDL组装有关[3-4]。肝脏CHO从头合成需要大量ATP供能，而高NEFA介导的肝脂损伤对CHO的合成影响特征尚不清晰，且通过添加适量CHO能否缓解高NEFA介导的肝脂损伤尚待验证。本试验以大鼠肝细胞为研究对象，利用高NEFA刺激建立肝脂损伤模型，通过分析添加不同浓度CHO对NEFA导致的肝脂沉积影响特征，以明确CHO在非酒精性脂肪肝中的调控机制，为非酒精性脂肪肝致病机制及防控研究提供重要理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料大鼠肝细胞BRL-3A购自中国科学院细胞库；胎牛血清购自CLACK公司；高糖DMEM干粉培养基购自Gibco公司；CHO、甲基-β环糊精(MβCD)购自Sigma；BSA购自BIOFROXX公司；反转录试剂盒购自TaKaRa公司；FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)均购自Roche公司；胰酶(0.25EDTA)、青链霉素购自北京索莱宝科技有限公司；Trizol和NEFAs购自Sigma公司；TG试剂盒和总胆固醇(TC)试剂盒购自北京普利莱基因技术有限公司；大鼠VLDL ELISA试剂盒购自朗顿公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒、Hochest核染购自碧云天公司；Bodipy493/503购自美国英杰生命技术有限公司。

1.2 CHO溶液的配制在细胞添加CHO溶液[5]，首先将干燥的CHO干粉加入无水乙醇中，在65°C溶解下，配成25 mmol/L CHO，然后将25 mmol/L CHO添加到甲基-β-环糊精(MβCD)水溶液中，最终配制的CHO浓度为3 mmol/L，MβCD质量浓度为44 g/L，于-20℃保存。

1.3 细胞处理大鼠肝细胞BRL-3A培养于6孔板，在含10%胎牛血清、1%青链霉素混合剂的DMEM高糖培养基中培养24 h,用无血清无双抗培养基饥饿处理2 h后，将BRL-3A细胞在含2%BSA的高糖DMEM培养基中添加1.2 mmol/L NEFAs培养30 min后，分别添加10、30、60、100和150 μmol/L 的MβCD-CHO(MβCD-CHO)溶液刺激12 h后收集细胞。

1.4 TC和TG的测定收集细胞利用普利莱试剂盒检测细胞中总TC和TG，具体步骤参考说明书。

1.5 大鼠VLDL含量检测收集细胞上清用VLDL ELISA剂盒检测，具体步骤参考说明书。

1.6 荧光定量RT-PCR法检测脂合成指标SREBP-1C、ACC1和CHO合成相关指标SREBP-2c的mRNA表达水平，按照Trizol试剂说明书来提取细胞总RNA，测定核酸蛋白浓度后，取2 μg总RNA按照反转录试剂盒说明书合成cDNA运用Roche SYBR GREEN染料法检测SREBP-1c、ACC1、SREBP-2c的mRNA表达水平。在NCBI上查找大鼠SREBP-1c、ACC1、SREBP-2c和Tbp mRNA序列，利用Primer Premier 5软件设计引物(表1)。QRT-PCR扩增体系(20 μL)：SYBR Premix Ex Taq 10 μL，Forward Prime(10 μmol/L)1 μL，Reverse Prime(10 μmol/L)1 μL，DEPC水6 μL，cDNA 2 μL。反应条件均为：95℃ 3 min；95℃ 10 s，56℃ 30 s，72℃，45 s；60℃ 15 s，40个循环。

表1 SREBP-1c、ACC1、SREBP-2c和TBP PCR引物序列

1.7 Bodipy 493/503脂滴荧光染色将BRL-3A细胞接种于放置有细胞爬片的12孔细胞板中，每孔细胞约5 000个。试验组加入1.2 mmol/L NEFA刺激30 min后，添加不同溶度MβCD-CHO溶液刺激12 h后，用PBS清洗3次，用4%多聚甲醛固定30 min，PBS清洗3次后，随后加入Bodipy 493/503染料进行避光染脂30 min，PBS避光清洗3次后，再避光加入Hoechst染料染核10 min，清洗3次后，甘油封片，激光共聚焦荧光显微镜上机检测。

2 结果

2.1 不同浓度CHO刺激对BRL-3A细胞内TC含量的影响NEFA组细胞TC的含量低于对照组。NEFA+10 μmol/L CHO组TC含量与对照组无显著差异。随着CHO浓度的增大，细胞内TC含量随之增多，尤其当添加60、100和150 μmol/L CHO刺激时，细胞内TC含量极显著高于对照组和NEFA组(P<0.01)(图1)。

*.与对照组相比差异显著(P<0.05)；**.与对照组相比差异极显著(P<0.01);#.与NEFA组相比差异显著(P<0.05)；##.与NEFA组相比差异极显著(P<0.01)。下同

2.2 不同浓度CHO刺激对BRL-3A细胞内SREBP-1c、ACC1、SREBP-2c mRNA表达的影响NEFA组的SREBP-1c、ACC1、SREBP-2c mRNA表达含量均显著高于对照组(P<0.05)(图2)。图2A、2B所示，NEFA+10 μmol/L CHO刺激时，细胞内SREBP-1c、ACC1mRNA表达含量与对照组相比无显著差异，但均显著低于NEFA组(P<0.05)，而30、60、100和150 μmol/L CHO刺激组的SREBP-1c和ACC1的含量均显著高于对照组和NEFA组(P<0.05)。如图2C所示，10 μmol/L CHO刺激时，细胞内SREBP-2c mRNA表达含量极显著高于对照组相(P<0.01)，但与NEFA组无显著差异，而30、60、100和150 μmol/L CHO刺激组的SREBP-2c mRNA表达含量均显著低于对照组和NEFA组(P<0.05)。

图2 不同处理组SREBP-1c、ACC1、SREBP-2c mRNA相对表达水平

2.3 不同浓度CHO刺激对BRL-3A细胞TG含量和脂滴的影响NEFA组细胞内TG和脂滴的含量显著高于对照组(P<0.05)(图3)。NEFA+10 μmol/L CHO组TG显著低于NEFA组(P<0.05)，与对照组差异不显著(图3A)。随着CHO浓度的增大，细胞内TG含量与对照组相比有增高的趋势，但无显著差异，与NEFA组相比无差异。NEFA+150 μmol/L CHO组细胞TG含量极显著高于对照组和NEFA组(P<0.01)。10 μmol/L CHO组的脂滴生成量显著低于NEFA组，且随CHO浓度增大，细胞脂滴的生成量均显著高于对照组和NEFA组。尤其当添加100和150 μmol/L CHO刺激时，细胞内脂滴含量极显著高于对照组和NEFA组(P<0.01)(图3B)。

图3 各组TG含量(A)和脂滴生成量(B)

2.4 不同浓度CHO刺激对BRL-3A细胞上清VLDL含量的影响NEFA组细胞上清VLDL的含量显著低于对照组(P<0.05)。NEFA+10 μmol/L CHO组VLDL含量显著低于对照组，而显著高于NEFA(P<0.05)。随着CHO浓度的增大，细胞VLDL含量随之降低，尤其当添加150 μmol/L CHO刺激时，VLDL含量极显著低于对照组和NEFA组(P<0.01)(图4)。

图4 细胞上清极低密度脂蛋白的含量

3 讨论

CHO是体内比较丰富的固醇类化合物，其代谢调节的关键器官是肝脏，肝脏能从头合成或从所有各种血浆脂蛋白中获取CHO[6]。同时肝脏中的CHO能通过合成胆固醇脂(CE)并以VLDL形式排出肝脏外[7]。当非酯化脂肪酸(NEFA)含量增高后，其脂肪组织的储存能力和各组织对NFFA的氧化能力不足时，过多的NFFA通过激活非氧化通路以TG形式在非脂肪组织过度沉积，造成脂肪的沉积[8]。ANNA等[9]研究发现DGAT2反义寡核苷酸(ASO)(DGAT2-ASO)抑制TG的合成增加了肝脏游离脂肪酸(FFA)含量，诱导了微粒体FFA氧化酶Cyp2E1活性增强，表明TG的合成通过减少游离脂肪酸的积累以保护肝脏免受脂质毒性。而VLDL是肝脏排出TG的主要途径，VLDL的合成不足致使大量TG蓄积将导致严重的肝脂损伤。因此，肝脏中TG含量低可能反映肝脏游离脂肪酸暴露量低，对TG合成的需求降低[10]。

本试验通过添加1.2 mmol/L NEFA刺激后，大鼠肝细胞呈现TG蓄积和脂肪变性等病变，且NEFA CHO水平低于对照组，表明NEFA组CHO水平低下与肝脂蓄积有重要相关性。添加不同浓度CHO刺激时，细胞内CHO水平随添加浓度升高而升高，通过结果可知，当10 μmol/L CHO刺激时，细胞内TC含量与对照组无差异，而T含量显著低于NEFA组(P<0.05)，但细胞上清中VLDL含量显著高于NEFA组，并且细胞内CHO合成相关指标SREBP-2c mRNA表达含量也高于NEFA组，表明添加10 μmol/L CHO能通过形成VLDL减轻高浓度NEFA造成的TG蓄积。并且由荧光定量和脂滴的结果显示，10 μmol/L CHO能显著降低细胞内脂肪从头合成相关基因SREBP-1c、ACC1的表达水平和脂滴含量，表明添加10 μmol/L CHO会减弱NEFA诱导的脂质沉积。但随着CHO浓度的增大，细胞内TC和TG含量不断增多，且细胞SREBP-1c、ACC1 mRNA表达含量和脂滴生成量与对照组相比显著升高(P<0.05)。尤其是150 μmol/L CHO刺激时，细胞内TG含量和脂滴生成量极显著增多，而SREBP-2c mRNA表达水平和VLDL含量极显著降低(P<0.01)，表明150 μmol/L CHO会进一步加重NEFA诱导的脂质沉积。SREBP-1c、ACC1的水平与肝脂合成正相关，低水平CHO促进了肝细胞脂转运，但高浓度NEFA和CHO刺激会引起细胞损伤及CHO稳态失衡而造成脂质毒性。高浓度CHO通过诱导胰岛素诱导基因(INSIG)介导的内质网SREBP裂解激活蛋白(SCAP)-SREBP-2复合体的保留而失活SREBP-2途径，从而下调CHO的生物合成和摄取[11]。并且研究表明[12]，高脂+高胆固醇饮食饲喂的动物肝脏中CHO的积累会诱导线粒体损伤和呼吸链复合物蛋白质的消耗。此外MARIA等[13]也证明肝脏中的CHO蓄积会导致线粒体变化，并可能使受损的肝细胞不断增殖以抵抗细胞死亡，从而使肝脏永久受损。因此本试验通过研究不同CHO浓度对NEFA诱导的脂质沉积的影响，表明低浓度的CHO能减缓高NEFA所致的肝细胞脂质沉积，为进一步治疗肝脂沉积相关疾病提供一定理论基础。