褪黑素在人子宫基质细胞增殖与分化过程中的作用

王婷婷，张 静，黄吉成，柳 舒，岳占碰，杨占清，郭 斌(吉林大学 动物医学学院，吉林 长春 130062)

子宫基质细胞在月经分泌中期卵巢性激素的作用下可分化为蜕膜样细胞，在形态和功能上发生一定的改变[1]。人子宫内膜基质细胞在每个月经周期中经历连续的增殖、分化以及动态组织重塑，成为蜕膜状态。已有研究发现，子宫蜕膜异常可导致妊娠失败、习惯性流产、先兆子痫等不良后果[2]。

褪黑素(melatonin,MT)是由松果体产生的一种吲哚类激素，在哺乳动物生殖过程中起重要作用。给小鼠补充褪黑素后，可以增加子宫内膜腺体密度和子宫内膜的厚度，显著下调妊娠第6天小鼠血清中雌激素水平，而不改变孕激素水平[3]。在体外条件下，褪黑素可促进牛胚胎发育[4]。给兔补充褪黑素则会出现一些抗生殖机能的现象，表现为延缓性成熟，不利于自发性排卵和发情[5]。进一步研究发现，在子宫及胚胎中可以检测到褪黑素跨膜受体的表达，褪黑素通过与膜受体的相互作用调节细胞的增殖、分化等生理过程[6]。但有关褪黑素在子宫基质细胞增殖与分化过程中的作用目前还不清楚。

活性氧(reactive oxygen species,ROS)是体内一类由氧为主要成分的单电子还原产物，其中超氧阴离子(O2-)作为其主要成员介导多种细胞信号转导途径，可激活转录因子进而促进细胞的增殖和分化[7]。研究发现，褪黑素具有清除ROS的能力[8]，但褪黑素是否可通过ROS来影响子宫基质细胞的增殖与分化目前还不清楚。

本试验通过体外培养人子宫基质细胞系，添加褪黒素以及褪黑素受体抑制剂Luzindole后，利用流式细胞术、荧光定量PCR等方法，研究褪黑素在子宫基质细胞增殖和分化过程中的作用及调节机制，为进一步探明子宫蜕膜化机理及提高受孕率等提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验细胞本试验所用细胞为人子宫基质细胞系(CRL-4003),购自ATCC公司。

1.2 主要试剂Dulbecco改良Eagle’s培养基和Ham’s F-12培养基以1∶1混合(Sigma)；活性炭处理的胎牛血清(Gibco)；褪黑素和Luzindole为Sigma产品；Trizol和实时荧光定量PCR试剂盒为Roche产品；超氧化物阴离子探针试剂盒和EdU-488细胞增殖检测试剂盒为碧云天产品。

1.3 细胞培养和处理将子宫基质细胞复苏后迅速移至含有10%活性炭处理的胎牛血清Dulbecco改良Eagle's和Ham's F-12 1∶1混合物配成的培养基中，37℃、5%CO2的培养箱中培养。当细胞生长到对数生长期时，用含EDTA的胰酶消化铺到6孔板中。取对数生长期细胞，血清饥饿24 h，分组如下：褪黑素处理组(MT)：使用10 μmol/L褪黑素处理子宫基质细胞；对照组(CON)：加入等体积的含1/10无水乙醇的培养基；抑制剂组(MT+Luzin)：使用10 μmol/L Luzindole预处理2 h后，再加入10 μmol/L 褪黑素共处理。

1.4 流式细胞术检测细胞增殖子宫基质细胞血清饥饿培养24 h，更换成含2%血清的培养基后再添加褪黑处理24 h，按照EdU-488细胞增殖检测试剂盒说明书操作，通过流式细胞术检测细胞增殖变化。

1.5 流式细胞术检测细胞增殖周期子宫基质细胞血清饥饿培养24 h后，更换培养基并添加褪黑素处理24 h，将细胞消化并1 200 r/min离心，弃上清。加入1 mL PBS将沉淀混匀，将细胞悬液缓慢滴入持续振荡的3 mL 70%冰乙醇中，4℃固定过夜。PBS洗涤后，室温下用0.5 mL PI/RNase染色缓冲液(BD biosciences)染色15 min，通过流式细胞术检测细胞增殖周期变化。

1.6 荧光定量PCR根据GenBank中已发表的人子宫基质细胞分化标志基因IGFBP1和PRL的mRNA序列，在基因编码区内设计特异性引物(表1)。提取细胞总RNA，利用荧光定量PCR检测细胞IGFBP1和PRL的mRNA表达水平。反应体系、扩增条件和计算方法参照本实验室操作方法进行[9]。

表1 PCR引物序列

1.7 子宫基质细胞O2-水平检测按1.3方法处理细胞，按照试剂盒说明书装载探针，利用流式细胞术进行检测。

2 结果

2.1 褪黑素对子宫基质细胞增殖的影响为了检测褪黑素对子宫基质细胞增殖的影响，血清饥饿后添加褪黑素作用24 h，按照EdU细胞增殖试剂盒说明书操作并应用流式细胞术检测。结果发现，与对照组相比，添加褪黑素后，细胞的增殖没有明显改变(图1)。

A.流式细胞图；B.褪黑素对子宫基质细胞增殖的影响；CON.对照组；MT.褪黑素处理组。下同

2.2 褪黑素对子宫基质细胞增殖周期的影响为了研究褪黑素对子宫基质细胞增殖周期的影响，细胞血清饥饿后添加褪黑素处理24 h，经消化、染色后通过流式细胞术检测细胞的增殖周期。结果表明，与对照组相比，细胞增殖周期进程没有明显改变(图2)。

A.流式细胞图；B.褪黑素对子宫基质细胞细胞增殖周期的影响

2.3 褪黑素对子宫基质细胞分化的影响细胞经饥饿诱导后，添加褪黑素分别处理各组细胞6、12、24 h，利用荧光定量PCR检测细胞分化标志基因IGFBP1和PRL的mRNA表达。结果显示，与对照组相比，褪黑素处理组细胞中IGFBP1和PRL的表达量显著降低(图3)。

A.褪黑素对子宫基质细胞IGFBP1表达的影响；B.褪黑素对子宫基质细胞PRL表达的影响;*示差异显著(P<0.05)。下同

2.4 Luzindole抑制褪黑素受体后褪黑素对子宫基质细胞分化的影响在子宫基质细胞中加入Luzindole预处理2 h后，再加入褪黑素作用12 h。结果发现，褪黑素可显著抑制子宫基质细胞中IGFBP1和PRL的表达，而添加Luzindole可减弱褪黑素对IGFBP1和PRL表达的抑制作用(图4)。

图4 Luzindole对褪黑素处理的子宫基质细胞分化标志物IGFBP1(A)和PRL(B)mRNA表达的影响(MT+Luzin·MT+Luzindole处理组)

2.5 褪黑素对子宫基质细胞中O2-的影响为了进一步研究褪黑素对子宫基质细胞O2-含量的影响，结合DHE荧光探针，通过流式细胞术检测细胞内超氧阴离子水平的变化。结果显示，与对照组相比，褪黑素可引起细胞中超氧阴离子含量的明显下降，而加入Luzindole可阻碍褪黑素对细胞中超氧阴离子含量的影响(图5)。

A.对照组流式细胞图；B.添加褪黑素处理后流式细胞图；C.Luzindole与褪黑素共处理后流式细胞图；D.褪黑素对子宫基质细胞中O2-的影响

3 讨论

人子宫内膜是一种动态组织，需要经历循环再生，包括连续增殖、分化、分解和修复。当胚泡植入子宫时，子宫内膜基质细胞可经历广泛的分化、血管重建和免疫细胞募集，这一过程被称为蜕膜化，可为胎盘成熟前滋养发育中的胚胎提供营养[1]。已有研究证实，蜕膜化对于妊娠的建立和维持至关重要[10]，蜕膜化受到损伤时通常与复发性流产、先兆子痫以及在临床环境中子宫内生长受限和不明原因的不孕症相关[11-12]。

褪黑素是由松果体所分泌产生的一种吲哚类激素，在哺乳动物胚胎发育、卵泡发育以及胚胎植入等过程中起着非常重要的作用。为了研究褪黑素对子宫基质细胞增殖的影响，本试验模拟人口服褪黑素的浓度，利用流式细胞术检测了细胞增殖的改变，结果发现，褪黑素不影响子宫基质细胞的增殖过程。向子宫基质细胞中添加褪黑素后，利用流式细胞术检测细胞增殖周期的改变，结果发现，对照组与试验组细胞基本都处于DNA复制前的G0/G1期，进一步证明了褪黑素对子宫基质细胞增殖周期没有明显改变。提示褪黑素可能并不影响子宫基质细胞的增殖过程。

IGFBP1和PRL是子宫基质细胞发生分化的标志基因[2,13]。实时荧光定量检测显示褪黑素可以抑制细胞分化标志物IGFBP1和PRL mRNA的表达水平，表明褪黑素可显著抑制子宫基质细胞的分化水平。已有很多研究发现，在雌性动物的子宫中存在褪黑素受体，褪黑素可通过与其受体结合发挥生物学功能[14-16]。在本研究中，Luzindole预处理细胞2 h后，再与褪黑素作用12 h，结果发现褪黑素对子宫基质细胞分化抑制作用可得到恢复，这表明褪黑素可通过与细胞膜上的受体作用来调节子宫基质细胞的分化水平。

ROS是需氧细胞在代谢过程中所产生的一种活性氧簇，包括O2-、过氧化氢(H2O2)、羟基自由基(·OH)和一氧化氮等，可作为一种信号分子来调节细胞的增殖与分化。在小鼠精原干细胞中添加ROS清除剂后，ROS水平显著减少，细胞的增殖与分化受到了明显的抑制；而添加H2O2使ROS水平升高后，则可恢复精原干细胞的增殖与分化[17]。进一步研究发现，补充褪黑素可使小鼠精原干细胞中ROS水平减弱[18]。为了明确子宫基质细胞分化过程中褪黑素与ROS的关系，本研究利用流式细胞术检测对照组、褪黑素组以及褪黑素与Luzindole共处理组细胞中的O2-水平。结果显示，与对照组相比，添加褪黑素可使子宫基质细胞中O2-水平减少，而补充Luzindole则可减弱褪黑素对O2-的抑制作用，提示褪黑素可通过O2-来介导子宫基质细胞的分化过程。

综上所述，褪黑素可通过O2-来影响人子宫基质细胞的分化，但对子宫基质细胞增殖并没有发生明显的作用。