纳米技术和纳米材料在结核防治中的应用

刘一朵，梁正敏，赵德明，周向梅 (中国农业大学 动物医学学院，北京 100193)

结核病是最致命的人畜共患病之一，他是全球十大死亡原因之一，也是世界范围内的公共卫生问题。据世界卫生组织(WHO)统计，2018年，在全球范围内估计有1 000万人罹患结核病，而中国预估有86万新发结核病病例，仍是结核病高负担国家[1]。同时，全球因牛结核病造成的损失高达30亿美元，在部分发展中国家，牛结核病威胁着人类健康[2]。由于卡介苗对于成人保护和不同地区保护力不同的局限性以及耐药性结核不容乐观的控制现状，亟需开发新的策略来预防和控制人畜结核病。

纳米技术是目前热门的研究方向之一，基于其制备的纳米制剂在生物医学上具有广泛的应用潜力。由于纳米制剂的高反应活性和大比表面积，是良好的吸附剂、催化剂和传感器。纳米递送系统是指将目的药物或者抗原成分溶解，包裹于脂质体或高分聚合物等载体系统制成纳米颗粒。基于纳米颗粒的递送系统具有优良的机体相容性和靶向性，易于通过生物屏障，可以提高药物的生物利用度，在结核防治方面具有良好的发展前景。同样，基于纳米技术的检测方法作为结核诊断手段也正在受到关注。本研究综述了纳米技术在结核病治疗、预防和检测方面的应用及优点。

1 纳米系统在结核治疗中的应用

针对敏感型结核的治疗标准方案通常是一线药物异烟肼(isoniazid，INH)、利福平(rifampicin,RFP)、吡嗪酰胺(pyrazinamide,PZA)和乙胺丁醇(ethambutol,EMB)联合使用6个月，每种药物都有毒副作用且长期用药易产生耐药性和病人依从性降低的问题。而耐药菌株的出现使结核的治疗更为复杂，根据WHO的数据[1]，2018年约有50万利福平耐药结核病病例(其中78%为耐多药结核病)，如何控制结核耐药性的产生成为世界性难题。纳米系统在结核治疗上的研究已取得了显著进展,纳米递送系统可提高药物的生物利用度、减少给药剂量和频率、增加可能的给药途径,增强药物的稳定性,且成本低,是一种具有广泛应用前景的新型抗结核方法。

1.1 脂质体脂质体是50～100 nm大小的球形微囊，通常具有脂质双层外壳和水相内核。根据药物性质，可以选择将药物包裹于脂质体的亲水内核或脂质层，将其准确递送至靶器官或者靶细胞。脂质体具有良好的生物可降解性和靶向性，易于透过生物膜，通过缓慢释放药物，从而减少了暴露于敏感组织或器官的药量，减少毒副作用和耐药性的产生，是靶向递送药物的理想载体。已有针对真菌感染的脂质体两性霉素B和针对乳腺癌的脂质体阿霉素被批准上市[3],显示出脂质体用于结核病治疗的应用前景。

近年研究表明脂质体是良好的抗结核药物递送系统，包裹利福布汀的脂质体与传统利福布汀给药相比，在小鼠感染结核模型中减少了肺脏和脾脏的载菌量，肺部病理损伤也有所减轻，而其中用二棕榈酰磷脂酰胆碱∶二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPC∶DPPG)制备的脂质体制剂最有效[4];MANCA等[5]发现脂质体的脂质成分对利福平向肺部递送有影响，其中外壳磷脂成分更高的利福平脂质体表现出更优良的雾化性质以及被细胞摄取的能力，可以通过呼吸道有效递送药物；松萝酸(UA)是一种已被证明对结核分枝杆菌有效的天然化合物，但效力不高，FERRAZ等[6]发现将松萝酸包裹进脂质体增强了其抗结核分枝杆菌效力，最低抑菌质量浓度由31.25 mg/L降至0.98 mg/L，与利福平联用也显示出良好的协同作用(分数抑制浓度指数FICI=0.28)。

1.2 纳米聚合物聚合物纳米颗粒是天然高分子材料或合成的具有生物相容性和生物可降解性的固体纳米胶体系统，可将药物溶解、截留、包封或吸附在其上递送至靶器官释放。线性聚合物如聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯等和两亲性嵌段共聚物是2种主要类型的聚合物纳米颗粒，被广泛用于抗菌药物的递送。这些聚合物可以改变颗粒大小、长度和表面活性剂，从而适用于不同给药方式。目前，聚乳酸-羟基乙酸共聚物(polylactic-co-glycolic acid，PLGA)及聚乳酸(polylactic acid,PLA)被认为是无害、无刺激的的绿色高分子聚合物，可在体内分解为乳酸[7],也是常用于开发纳米制剂的高分子材料。

异烟肼作为亲水性抗结核药物在PLGA中的包载率较低，FARIA等[8]用柠檬酸处理异烟肼得到与其作用类似的异烟肼柠檬酸醛(JVA)，开发出JVA-PLGA纳米颗粒，提高了药物包封率。其研究表明JVA-PLGA可以增强巨噬细胞对分枝杆菌的杀伤作用，并促进药物细胞内生物利用度，可以直接与分枝杆菌相互作用，有助于以低药量杀灭肉芽肿中的细菌。为更有效的降低用药量，分枝杆菌细胞壁成分分枝杆菌酸(MA)被用于纳米颗粒表面作为靶向配体，LEMMER等[9]设计了一种包载异烟肼的新型纳米制剂MA-INH-PLGA,发现加入MA之后感染鸟分枝杆菌或牛分枝杆菌的巨噬细胞摄取纳米颗粒的能力显著增加，这可能是因为MA作为分枝杆菌的毒力因子及其胆甾类性质可以与感染细胞表面受体结合，从而也大大提高了药物进入细胞的速度及浓度。而在大鼠模型中，气溶胶形式吸入的甘露醇修饰的利福平PLGA纳米颗粒可长时间沉积于肺部并靶向巨噬细胞[10]。

1.3 纳米乳纳米乳或微乳是由水相、油相、乳化剂和助乳化剂按适当的比例形成的粒径为1～100 nm乳滴分散在另一种溶液中的热力学稳定体系[11]。纳米乳的类型与普通乳剂一样分3种，水包油(O/W)型、油包水(W/O)型及双连续型(W/O/W或O/W/O)，纳米乳可以提高难溶性药物的溶解度，发挥缓释作用，与脂质体分散系相比有更高的稳定度。MEHTA等[12]制备了以吐温80为表面活化剂的异烟肼微乳，是一种水包油型乳液，具有成本低、稳定性高、易于制备的优点，并能控制持续缓慢释放异烟肼。PETER等[13]开发了氯法齐明纳米乳，改善氯法齐明溶解性差和毒副作用的特点，并且在小鼠鸟分枝杆菌感染模型中，氯法齐明纳米乳显示出比脂质体载体更好的抗菌效力。

1.4 无机纳米材料作为抗菌材料，纳米颗粒可以通过递送抗生素发挥协同作用，也可以根据特性单独发挥作用。纳米金属或金属氧化物材料可以作为一种易于制备的抗菌材料，减少耐药性的产生。这类材料具有多种抗菌机制，如损伤细菌细胞膜、释放有毒的金属离子如Zn2+、Cd2+和Ag+，抑制细菌蛋白质及酶的合成等。

分枝杆菌需要吸收铁元素来合成分枝杆菌素，针对这一特性可以开发新的抗结核方法。NARAYANASAMY等[14]制备了Ga纳米颗粒，由于镓(Ga)与铁(Fe)的相似性，分枝杆菌错误地吸收了Ga3+从而阻断了Fe3+的结合位点，通过这一机制，Ga纳米颗粒成功抑制了HIV-TB合并感染巨噬细胞中病原体的生长。Ag纳米材料已确认了2种抗菌机制，包括接触杀伤和离子介导的杀伤[15]。此外，ZnO纳米材料的抗菌机制是产生活性氧(reactive oxygen species,ROS)，从而损伤细菌膜、DNA和蛋白质[16]。BANU等[17]评估了银纳米颗粒对耐药结核分枝杆菌的抗菌效力，发现质量浓度为6.25～12.5 mg/L可以抑制结核分枝杆菌的生长。HEIDARY等[18]研究了Ag、ZnO和Ag-ZnO纳米颗粒对耐药结核分枝杆菌的效力，结果显示，与单独使用相比，Ag和ZnO纳米颗粒联合对结核分枝杆菌菌株的杀伤更大，并且对耐药菌株的杀伤力大于对敏感菌株，表明Ag-ZnO纳米颗粒能有效抵抗耐药结核分枝杆菌。对于金属颗粒的毒性，可以考虑在纳米材料表面合成具有生物相容性的植物衍生的次生代谢产物涂层，以减少对人体健康的有害影响。

1.5 基于藻酸盐的纳米递送系统海藻酸是一种天然多糖，也是一种优良的高分子材料，其相对分子质量为10～60 kDa，具有污染小、可再生、无毒性、储量丰富等特点[19]。藻酸盐通常与壳聚糖联合使用在药物递送缓释方面有着广泛的应用。藻酸盐中存在阴离子羧基组可与阳离子壳聚糖紧密吸附，形成稳定的微球结构。藻酸盐作为水溶性聚合物在体内清除率比脂类载体高，但人体缺乏在分子水平降解高分子藻酸盐的酶，所以藻酸盐的相对分子质量应保持在50 kDa以下，以便肾脏能够清除[20]。ZAHOOR等[21]制备了包裹异烟肼、利福平和吡嗪酰胺的雾化藻酸盐纳米颗粒，发现雾化15 d，所有器官(肺脏，肝脏和脾脏)中的所有药物均高于最低抑制浓度，而游离药物仅1 d。

2 纳米系统在结核疫苗中的应用

2015年，欧洲药品管理局(EMA)认为新型疟疾疫苗Mosquirix可被用于非洲6周到17个月的儿童免疫接种，该疫苗含有纳米级脂质体佐剂[22]，显示出纳米制剂在开发疫苗方面的远大前景。针对结核分枝杆菌这类胞内寄生菌，对能够调节机体Th1细胞依赖性免疫的疫苗有迫切需要，这对于机体获得持久免疫力和有效保护力有着关键作用。与传统疫苗相比，纳米疫苗具有生物相容性、非免疫原性和靶向性的特点，并且可以长时间缓慢且持续地释放抗原,一些纳米颗粒具有易于被APC(antigen present cell)摄取的能力，在结核疫苗开发方面显示出足够的潜力。

近期，纳米系统在结核疫苗方面的应用研究主要集中于包载或吸附结核抗原以及抗菌肽。HART等[23]利用纳米级的巴西棕榈蜡制备了包载有结核抗原Ag85B(早期表达)、Acr(后期表达)和HBHA(黏附素)融合蛋白的新型疫苗，在小鼠结核感染模型中能有效增强BCG的免疫效果，并诱导大量CD4+细胞和CD8+细胞增殖以及肺部组织驻留记忆T细胞的产生。MALIK等[24]开发了一种H1-PLGA结核疫苗，包载结核抗原Ag85B-ESAT6融合蛋白，单剂该疫苗接种6周后，与单独Ag85B-ESAT6相比，H1-PLGA免疫的C57BL/6J小鼠血清抗体显著增加，并且IFN-γ和TNF-α水平分别升高了约6.03和2.80倍，显示出强烈的Th1细胞免疫反应。抗菌肽是各种动植物等生物体非特异性免疫中的重要组成成分，既可以在免疫反应过程中发挥正向作用，又能反向调节使机体免疫功能恢复正常,经常用于疫苗的免疫增强剂。SILVA等[25]将抗菌肽LLKKK18包在纳米凝胶中，发现其能被巨噬细胞有效摄取，体内体外试验均能有效降低结核分枝杆菌载量。

纳米疫苗递送系统具有同时将抗原和免疫增强剂递送至相同树突细胞或巨噬细胞的能力,聚合物纳米粒子具有可调整的特性，是一种理想的载体，其中PLGA颗粒的表面经过一定的修饰能够诱导黏膜免疫，增强免疫效果，并能够弥补亚单位疫苗口服或鼻腔给药的弊端。本课题组选用PLGA高分子材料包封结核分枝杆菌抗原argF蛋白[26]和CFP-10蛋白[27]，制备了2种防治牛分枝杆菌感染的亚单位纳米微粒，在体外和体内试验中验证了这2种纳米微粒在一定程度上能有效增强卡介苗诱导的抗结核免疫力，相关纳米疫苗的研究也在进行中。

3 纳米技术在结核诊断中的应用

为了控制结核的传播，及时和准确的诊断手段至关重要。纳米粒子的物理和化学性质允许进行准确、快速、灵敏和经济高效的诊断，现已开发多种基于纳米技术的检测方法。

QIN等[28]建立了一种基于荧光纳米粒子的间接免疫荧光显微镜技术(FNP-IIFM)，使用抗结核分枝杆菌抗体识别结核分枝杆菌的一抗，然后在标记的二氧化硅纳米颗粒包裹抗体结合蛋白(蛋白质A)，随之产生荧光信号进行显微镜检查，与传统方法相比有更强的信号和光稳定性，可以在4 h内检测结核分枝杆菌复合物。DNA纳米金探针技术是目前热门的结核检测研究方向，该方法灵敏度高，操作简便，适合于发展中国家推广。2017年，TSAI等[29]开发了一种纳米金探针技术用于结核检测，该方法基于与检测样品DNA杂交的单链DNA探针分子的作用，DNA杂交改变了纳米颗粒的表面电荷密度发生不同程度的聚集，从而影响金纳米颗粒的颜色变化，通过在纸质平台显色并比色,达到了1.95×10-2μg/L的检测限。李海燕等[30]将纳米金技术与基因芯片结合开发了一种DNA纳米金探针新方法，通过纳米金颗粒将检测信号放大，并通过生物素化的信号探针显色将基因芯片上的检测信号转化成肉眼可见的信号或通过普通仪器即可扫描的信号，从而确定样本中细菌核酸的存在。

在动物结核检测方面，CHEN等[31]开发了一种金纳米颗粒修饰的纳米生物传感器用于快速检测牛奶中的牛分枝杆菌，检测限达到了3.5×103CFU/mL，该方法将壳聚糖、金纳米颗粒(AuNPs)和碱性磷酸酶标记的山羊抗小鼠抗体(ALP-IgG)的混合溶液滴加到玻碳电极上形成具有良好性能的坚固膜即生物传感器，通过抗分枝杆菌的抗体与ALP-IgG的反应，可鉴定是否有牛分枝杆菌被固定在膜上,纳米技术在结核诊断方面也有巨大潜力。

4 建议与展望

纳米颗粒具有3种特点[32]：尺寸微小，易通过生物屏障和组织间隙，在细胞水平释放所载药物；表面原子处于高能状态，常具有催化活性;避免药物和体液直接接触，一来减少毒副作用，二来保存所载抗原的活性，有利于抗原的持续作用。近年来的研究表明，不同纳米材料在结核防治中优缺点各异(表1)，在控制人畜结核方面有着巨大潜力。尽管如此，纳米技术在结核上的应用也有一些难题，如纳米颗粒的安全性问题和纳米技术在潜伏性结核感染上的局限性。

表1 不同纳米材料在结核防治中的优缺点

粒径、电位、表面亲疏水性等理化性质往往可以决定纳米颗粒被细胞摄取和细胞作用的方式，对纳米颗粒理化性质的深入研究有助于开发出更高效的纳米递送系统，增加包载药物或抗原与细胞的接触机会；开发对人体危害小或者无害的纳米系统，可以选择天然绿色化合物修饰载体材料，减少纳米颗粒的毒性；根据结核感染和机体免疫的特性设计纳米材料，PI 等[33]根据结核分枝杆菌能逃逸溶酶体吞噬并限制药物进入宿主细胞这一特性设计了一种靶向巨噬细胞的异烟肼纳米硒颗粒，该纳米颗粒可以迅速进入巨噬细胞释放异烟肼，促进细菌与溶酶体融合并与异烟肼协同杀伤细菌。

相信随着纳米技术的发展和科学研究的不断深入，会有更多的纳米药物、纳米疫苗和纳米诊断方法进入临床，为人畜结核的防控提供更有效的药物、疫苗和诊断方法。